Qu’est ce que l’écologie microbienne
étude des interactions :
entre micro-organismes et l'environnement,
entre les populations microbiennes,
entre microorganismes et les organismes supérieurs végétaux et animaux
étude du rôle microorganismes dans le fonctionnement des écosystèmes naturels ou anthropisés
étude des mécanismes du pouvoir pathogène des microorganismes et des réactions de l'hôte
exploitation des activités microbiennes dans les domaines de la santé, l'agronomie, l'environnement et l'industrie
méthodologies et outils moléculaires et biochimiques permettant:
de détecter et de caractériser les micro-organismes en milieu naturel
d'étudier leur diversité
de mesurer leur activité
d'évaluer leur pathogénicité
d'étudier leur devenir en environnement complexe
Ecologie Microbienne des Aliments
Introduction en( 6 questions)
1- Pourquoi conserver les aliments ? Pour ajuster production et consommation. Aliments périssables
2- Qu'est-ce qui gâte l'aliment ?
La dégradation des aliments est surtout due aux germes (bactéries, moisissures), et c'est ceque l'on va étudier ci-après. Dégradation due aussi aux "pests" (insectes), aux enzymes (peroxydase des petits pois, polygalacturonase qui hydrolyse la pectine des tomates…), et à des facteurs physiques (transfert de gaz dans l'oeuf) et chimiques (oxydation des lipides).
3- Qu'est-ce que l’écologie vient faire ici ?
Ecologie = étude des interactions (les vivants dans leur environnement). Ici, les microorganismes, l’environnement c’est les aliments. Faire de l’écologie c’est étudier les facteurs environnementaux qui déterminent la croissance (ou la non-croissance) de chaque microorganisme. Le but étant d’utiliser ces facteurs comme « barrières » pour conserver l’aliment sous forme comestible le plus longtemps possible.
4- Comment résister aux microbes ?
Pour conserver les aliments, il faut combattre les germes, par 3 approches complémentaires :
1- Eviter la contamination,
2- Tuer les germes, et/ou
3- Inhiber leur développement =>
5- Le plus important de ce cours:
1- On peut tuer les bactéries par la chaleur. Retenir qq t°C critiques + expliquer D& z (je crois qu’il parle ici de thermo bactériologie voir cour de azokpota remise à niveau)
2- On peut inhiber les bactéries par le froid. Il faut retenir quelques t°C critiques
3- Les aliments "secs" ou "acides" sont protégés. Il faut savoir quelques aw et pH critiques (facteurs intrinsèque ‘activité de l’eau et l’acidité composition etc.)
I - Micro-organismes des aliments : Contaminations
1.1- Nature des micro-organismes:
Bactéries, Moisissures, et Levures peuvent se développer dans l'aliment et le dégrader. Parasites et Virus n'y "poussent" pas mais peuvent présenter un danger pour le consommateur
1.2- Conséquences de la présence de micro-organismes: amélioration, dégradation, danger
Ø Positif (Avantage) : Amélioration de l'aliment: meilleure conservation et qualités organoleptiques, grâce à une flore utile, auxiliaire de fabrication (ex: yaourt, choucroute, fromage, vin…)
Ø Négative (inconvénient) : Dégradation de l'aliment: détérioration des qualités diététiques et organoleptiques, à cause de la flore banale de contamination (germes non pathogènes qui pourrissent, moisissent, ramollissent, poissent et créent de mauvaises odeurs et couleurs sur les aliments = répugnant)
Ø Danger pour le consommateur:
– Accumulation de bactéries pathogènes & leurs toxines (ex. Salmonelles, TIAC)
– Accumulation de métabolites toxiques (mycotoxines, catabolites toxiques comme l'histamine les amines biogènes)
1.3- Contaminations : origine des micro-organismes dans les aliments
1.3.1- Contamination endogène (maladie infectieuse, bactériémie)
- L’animal est malade ou porte le germe avant l’abattage (exemple salmonellose chez les volailles). Pour pallier ce type de contamination on interdit l’abatage et la consommation des animaux malade (grippe aviaire, Arrêté Ministériel d’octobre 2007 au bénin : abattage des animaux malades interdit). Ou alors l’animal est sain mais présente des lésions par lesquels les microbes l’envahissent (Rôle de l’inspection sanitaire pour éliminer ces carcasses de la chaîne alimentaire)
- Contamination endogène par bactériémie
– Bactériémie digestive/bactériémie d’abattage: il y a un passage post-prandial normal de bactéries et de spores depuis la lumière intestinale vers le sang ou la lymphe (Importance de la diète hydrique, de la saignée complète, éviscération précoce, dans les élevages de poules pondeuses avec infection latente par Salmonella enteritidis, certains oeufs sont contaminés avant la ponte (contamination verticale))
1.3.2- Contamination exogène (animal, environnement, personnel)
* Germes présents "sur" l’animal: il faut éviter leur transfert à viande, oeuf, lait
* Contamination par l’environnement :
Matières-I, Matériel, Milieu, Méthode et Main d'oeuvre,Milieu : Bâtiments et locaux
Matières premières: contamination croisée (ex.: épices pleines de spores de Bacillus, légumes terreux…)
Main d'oeuvre : Hygiène & formation du personnel. Problème des porteurs sains
II – Multiplication des microorganismes dans les aliments
2.1- Courbe de croissance
X= temps, Y= Log10 (nb cell./ml)
En simplifiant on distingue 4 phases:
A ou 1- phase de latence
B ou 2- phase de croissance exponentielle
C ou 3- phase stationnaire
D ou 4- phase de décroissance
Je représente ici la courbe de croissance
En fait les courbes réelles sont plus arrondies, le plateau dure longtemps, et la décroissance est lente. On distingue aussi parfois une phase d'accélération (entre A & B) et une phase de décélération (entre B-C).
2.1.1- phase de latence: le taux de croissance est nul,
Le nombre de bactéries est constant. Les germes se réparent et se préparent: Ils s'adaptent au milieu en synthétisant les enzymes nécessaires, et se réparent trous et cassures. La durée de latence dépend de l'état du germe (fort inoculum en phase exponentielle dans milieu identique = latence très brève; germes très peu nombreux stockés au frigo ou lyophilisés = la latence longue).
La latence sera longue si faible inoculum ou milieu défavorable (pH acide, température basse).
2.1.2- phase de croissance exponentielle
Elle donne une droite en Log : taux de croissance maximal, chaque cellules peut se diviser, il n'y a pas de nutriment limitant.
Pour des bactéries "rapides", T=15-20 min (3 ou 4 doublements par heure).
2.1.3- phase de croissance stationnaire:
Cette phase n’est pas statique, mais autant de germes meurent que de germes naissent. C'est le milieu de culture (ou l'aliment) qui détermine la densité bactérienne au "plateau", qui est fonction du nutriment limitant, et éventuellement des compétitions entre bactéries d'espèces différentes (c'est ça, l'écologie).
2.1.4- phase de décroissance:
Elle correspond à la lyse des bactéries, car trop de "déchets" dans le milieu (par ex acide lactique qui diminue le pH) et plus assez de nutriments.
2.2- L'effet des bactéries
Cet effet dépend de leur Densité :
Les effets des bactéries ne sont "visibles" qu'au delà d'une certaine densité
(sauf germes très pathogènes: une seule cellule de Mycobacterium peut donner une tuberculose)
- 106 germes/g suffisent en général à donner une TIAC (dose minimale infectieuse Salmonelles)
- 107 germes/g suffisent à donner une odeur désagréable à un aliment, à troubler un liquide
- 108 germes/g suffisent à modifier l'aspect de surface (limon gluant)
- 109 germes = une colonie visible sur une boite de pétri
2.3- Les facteurs nécessaires à la croissance bactérienne
Pour croître la bactérie a besoin d' Eau + Temps + Température + Acidité + Nutriments + Oxygène.
Les valeurs critiques pour ces paramètre dépendent de l'espèce bactérienne
E- Eau, humidité suffisante, mesurée par: Aw
T- Temps : durée suffisante dans les bonnes conditions
T- Température permettant la croissance
A- Acidité, pH permettant la croissance. Bactery préfère la neutralité. Est-elle Suisse ?
N- Nutriments (ou composition chimique): les bactéries doivent manger (concentration acceptable)
O- Oxygène, ou PAS d'oxygène (anaérobiose) : cela dépend de la bactérie
La teneur en eau, le pH et les nutriments sont "dans l'aliment": facteurs intrinsèques
La température (et le temps) et l'oxygènes sont "autour de l'aliment": extrinsèques
Notons que les facteurs extrinsèques sont plus faciles à modifier.
2.3.1- Facteurs extrinsèques
2.3.1.1- Température:
Rien de plus important que la température dans les extrinsèques Chaud tue – Froid stoppe. C'est simple, mais très important :
- Température supérieure à t°C maxi TUE les bactéries (en dénaturant leurs enzymes protéine et autres). Sauf s'il y a des spores. Donc le chaud va permettre de stériliser les aliments, stables ensuite à t°C ambiante.
- Température inférieure à t°C mini STOPPE les bactéries (enzymes immobilisées).
Donc, le froid ne va PAS stériliser les aliments. Ils sont stables tant qu'il fait froid, mais quand la t°C remonte, les germes redémarrent et l'aliment peut se dégrader.
Ø Action de la CHALEUR sur les bactéries
La chaleur peut tuer les bactéries. Car elle inactive les enzymes et coagule les protéines de structure (dénaturation irréversible), il stoppe la réplication de l'ADN. Les paramètre d’application de la chaleur dépendent de (on doit chauffer plus ou moins suivant) :
- la thermorésistance de "la bactérie",
- le nombre de bactéries à détruire (la charge microbienne)
- les conditions de milieu (pH notamment)
- le type d'aliment à obtenir (pasteurisé ou stérilisé).
La thermorésistance, c'est la capacité d'une bactérie à résister à un traitement thermique létal, caractérisée par 3 paramètres: D à une température donnée (t°C) et Z et F.
Dt : temps de réduction Décimal (D comme Dé-cimal, et D est un temps, en minutes) (N/10)
Z = augmentation de t°C divisant D par 10
Facteurs de variation de la thermorésistance des germes
- Acidité: la thermorésistance s'abaisse quand le pH s'abaisse. A pH acide, D diminue (il faut moins longtemps pour stériliser, surtout si pH<4.5). C'est pour cela qu'on rajoute des aliments acides dans les conserves de poisson (maquereau au vin blanc, sardines au citron ou à la tomate): cela permet de les stériliser sans les chauffer trop.
- Composition de l’aliment: protéines et les lipides "protègent" les bactéries, et augmentent la thermorésistance. Sauf les acides gras polyinsaturés
- Activité en eau: la stérilisation est plus facile en milieu humide. L'eau favorise le transfert de chaleur, et "ramolli" les bactéries (bof?). Par contre la stérilisation est difficile en milieu gras ou sec:
- Transfert de chaleur et physique de l'aliment : masse, forme, liquide ou solide, …
- Facteurs de thermorésistance liés aux germes:
Nature des micro-organismes: évident, sporulés, non sporulés. & streptocoques, coliformes
Nombre initial de germes: évident, plus il y de germes, plus ils résistent (Aussi: les substances libérées par les germes tués peuvent protéger les autres.
Stade physiologique: évident pour spore > forme végétative.
Association de germes: les plus résistants peuvent "aider" les autres (composés protecteurs)
Ø Action du FROID sur les bactéries
On classe les bactéries en bactéries psychrophiles, mésophiles, thermophiles.
Psychrophile: ne pousse qu'à température basse, mini: -5/5°C, opti: 12/15°C, maxi: 15/20°C
Psychrotrophe : aime froid, mais supporte tiède. mini -1/5°C, opti: 25/30°C, maxi: 35/40°C
Mésophile: mini 5/15°C, opti: 30/45°C, maxi: 35/50°C
Thermophile: termonichochô: mini: 35/45°, opti: 55/75°C, maxi: 60/90°C
Remarques
- Les thermophiles poussent beaucoup plus vite que les autres, mais meurent vite aussi (sauf s'ils font des spores) par ex.: dans une boite de conserve "ratée" contenant des spores thermophiles, et testée à 55°C, le plateau est atteint en quelques h, et la boite gonfle, mais "auto-stérilisation" en 12 h.
- Psychrophiles poussent plus lentement que les autres, et persistent très longtemps Par ex.: dans un frigo pas assez froid, les listeria atteignent leur plateau en quelques jours, et persistent des semaines…
- Psychrotrophes et Psychrophiles: température mini 0°C, mais croissance lente.
- Mésophiles (majorité des pathogènes): t mini 10°C, t optimale: 37°C, t maxi: 50°C
Ø Effets du froid sur les bactéries
Réfrigération correspond à l’abaissement de la température à une valeur inférieure à la température ambiante mais supérieure au point de congélation du produit (l'eau reste liquide. La réfrigération diminue la vitesse de croissance (augmente le temps de doublement) et diminue la vitesse de démarrage (augmente la phase de latence).
Elle permet donc une augmentation de la durée de conservation (la viande se garde 1 jour à 22°C mais 10 j à 0°C). La réfrigération sélectionne les bactéries psychrophiles (ex.: bien que "lentes", Peudomonas & Listeria sont avantagées au frigo) et amène les bactéries vers une nouvelle adaptation
Congélation correspond à l’abaissement de la température à une valeur inférieure au point de congélation (zéro degré dans l'eau pure, mais pour la viande : <-1,4°C). Elle arrête la croissance bactérienne (eau libre disparaît, lipides membranes solides). La congélation tue certaines bactéries (9 cellules Gram- sur 10): effet létal partiel et sélectif (coques et gram+ résistent mieux).
2.3.1.2- Redox : Potentiel d'oxydo-réduction et Oxygène
Le potentiel redox est la capacité à accepter ou céder des électrons (oxydation:perte d’électron / réduction: gain d’électron)
Dans l'aliment, le potentiel redox est difficile à mesurer et variable dans le temps.
Les bactéries ont des comportements variés vis à vis du potentiel redox et de l'oxygène:
- Aérobies stricts: exemple Pseudomonas psychrophiles des tanks à lait, Bacillus Ces bactéries profitent (comme nous) de la respiration qui permet d'utiliser au mieux l'énergie des nutriments. Elles "détoxifient" les radicaux oxygénés grâce à des enzymes spécifiques (SOD= super oxyde dismutase, et catalase)
- Aérobies facultatifs ou Aéro-anaérobies: entérobactéries (Salmonella, E.coli), levures
- Microaérophiles: croissent en présence d'une faible teneur en O2: lactobacilles & autres bactéries lactiques. Non pathogènes, ils entrent en compétition avec les pathogènes. On les utilise dans les produits laitiers fermentés (yogourt, fromages), et sur les viandes sous atmosphère modifiée (milieu microaérophile sous l'emballage étanche de la barquette).
- Anaérobies stricts: Clostridium botulinum et perfringens.
Applications de ces concepts:
- désinfectants oxydants (eau oxygénée, acide peracétique, produits chlorés ou iodés)
- risque des TIAC à Clostridium dans les grosses pièces de viande.
- utilisation des atmosphères modifiées pour favoriser les lactobacilles
2.3.2- Facteurs intrinsèques
Eau, pH, redox, composition et structure
2.3.2.1- Eau : Eau disponible (activité en eau)
aw c'est l'activité en eau de l'aliment, ou activité hydrique. Attention ! Ce n'est PAS la teneur en eau (eau "totale"). aw c'est l'eau disponible pour la multiplication des germes (de 0 à 1). C'est aussi l'eau qui peut s'évaporer à la température ambiante
Ø Mesure de l'aw
Dans une enceinte, avec un hygromètre. On mesure le taux d'humidité de l'air à l'équilibre sur de l'eau pure (référence 100%). On mesure ensuite le taux d'humidité sur l'aliment à tester. L'aw est le rapport des deux taux (aw de l'eau pure = 1.00)
Ø Comment baisser l'aw ?
Les germes ont besoin d'eau disponible pour pousser. Les aliments naturels ont des aw élevés (0.98 - 0.99), qui conviennent parfaitement aux germes..
Viande, poissons aw = 0.99 (teneur en eau 75%)
Légumes aw = 0.99
Fruits aw = 0.98
Charcuterie sèche aw = 0.85-0.95
Pain frais aw = 0.78 (teneur en eau 30%)
Confitures aw = 0.75-0.80
Céréales aw = 0.70
Nouilles, épices aw = 0.30-0.50
Pour inhiber, faut baisser l'aw. On va donc chercher à diminuer l'aw des aliments pour diminuer la croissance des germes.
- Enlever de l'eau: sécher, déshydrater, voire lyophiliser.
- Ajouter sel ou sucre (ou composés de petit PM) rend l'eau indisponible et abaisse l'aw :
A 25°C, aw = 0.9 pour une solution de sel (NaCl) à 160g/l et pour une solution de sucre (saccharose) de 1400 g/l.
- Congeler aussi abaisse l'aw (glace à -18°C . aw = 0.84)
Remarques
Attention ne pas confondre aw et teneur en eau, même s'il y a un lien entre les deux. Par exemple, les fruits secs contiennent 20% d'eau, la viande séchée 10% d'eau et les noix sèche 5% d'eau. Or ils ont tous trois la même aw = 0.7. Pour ceux qui veulent savoir quel lien il y a, c'est exprimé par la courbe de sorption:
Je dois insérer ici les courbes de sorption
- Aux très faibles teneurs en eau, tout est très fortement lié, jusqu'à aw =0.65 (rien ne pousse)
- Quand la teneur en eau augmente au delà, une partie de l'eau devient disponible (eau solvante)
- Cependant si dans cette eau il y a beaucoup d'ions, d'électrolytes, de molécules de petit PM comme le sucre des fruits sec, l'aw monte peu, et l'eau n'est pas disponibles pour les bactéries.
Comme avec le froid, on range les micro-organismes dans différentes classes suivant leur résistance aux activité de l’eau: Hygrophiles, mésophiles, xérophiles (xeros = sec en grec). On parle aussi de halotolérants et halophiles (halos = sel en grec). Mais le plus utile à savoir c'est que
- les bactéries "normales" ont besoin de beaucoup d'eau libre: Bactéries 0,93 < aw < 0,99
- les coques tolèrent mieux le sec que les bacilles, et S. aureus est la plus "dromadaire" des bactéries pathogènes
- Staphylococcus aureus : aw limite 0.86 mais croissance au dessus de 0.90
- les levures arrivent à croître au dessus de 0.8
- les moisissures sont les plus résistantes au sec, et poussent au dessus de 0.7, mais lentement.
Pour les bactéries pathogènes les seuils minimaux de croissance sont :
aw > 0.95 Clostridium perfringens
aw > 0.94 Salmonelles
aw > 0.93 Clostridium botulinum (correspond à 10% de NaCl)
aw > 0.90 Staphylococcus aureus (on trouve aussi la valeur 0.86 car staph pousse au dessus de 0.90, mais "résiste" au dessus de 0.86, et ne fabrique de toxine qu'à + de 0.93)
Réglementation: Préparation alimentaire stabilisée si aw ≤ 0.91
Stable aussi si aw < 0.95 et pH < 5.2
2.3.2.2- pH
Les bactéries se multiplient bien vers pH 7 mais chaque bactérie a un pH optimal de croissance (entre 4.5 et 9). Les bactéries lactiques ont un pH optimal voisin de 5. Staphylocoques et listeria sont relativement acido-tolérants (pH minimum croissance 4.2-4.3). Les levures (pH 2 à 9) et les moisissures (pH 1.5 à 10) ont des pH optimaux plus bas que les bactéries: les aliments acides moisissent facilement (pensez aux oranges) Donc, la réglementation dit que les aliments acides, pH < 4.5 sont considérés comme stables (pas de croissance bactérie)
Ø Quel est le pH des aliments ?
Certains aliments sont "très" acides: pas de croissance bactérienne possible (mais moisissures oui)
Ex : Yogourt pH 4.5 Jus et fruits pH 4 (3.5-4.9) Citron & vin 2, Coca pH 1.5, Estomac pH 1
D'autres aliments sont relativement acides et donc relativement protégés,
Ex : Viande pH 5.6 (après la phase de rigidité cadavérique, mais viande surmenée pH 6.2) Légumes pH 5.2-6.2 moins bien protégés que les fruits. Mais leur structure "cellulaire" rigide et leur pauvreté en protéines limite le développement bactérien dans les légumes, sauf bactéries spécialisées (Erwinia carotovora), non pathogènes pour nous. Le blanc d'oeuf a pH 9 (après quelques jours) est trop basique pour les salmonelles.
Par contre les aliments neutres, comme le poisson pH 7, sont très "fragiles".
Ø Pourquoi les bactéries sont elles inhibées à pH acide ?
- Modification de la disponibilité des métaux du milieu (co-facteurs enzymatiques)
- Modification de la perméabilité membranaire (perméases des cations bloquées par H+)
- Ralentissement du métabolisme enzymatique: si les acides entrent dans la cellule (cf. cidessus) le cytoplasme s'acidifie et les enzymes intracellulaires ne sont plus au pH optimum.
2.3.2.3- Structure physique et composition de l'aliment (nutriments)
Ø La Structure
La Structure physique de l'aliment constitue des Obstacles & barrières naturelles. Souvent les procédés technologiques conduisent à enlever ou fragiliser ces barrières. On doit donc les reconstituer si possible: emballages divers, "croûte" du pain et du fromage, gels et émulsions qui "immobilisent" les bactéries, et tous les autres procédés (pH, aw, t°C)
Ø Nutriments favorables aux bactéries : Composition de l’aliment:
- Les aliments d'origine animale ou végétale sont a priori favorables au développent bactérien, car ils contiennent tous les nutriments nécessaires. Cependant l'équilibre de ces nutriments peut favoriser tel ou tel germe. Ainsi les produits sucrés (jus raisin) favorisent les levures.
- Les bactéries utilisent plus facilement le glucose que l'amidon, et les acides aminés que les protéines, mais beaucoup de micro-organismes ont des enzymes protéolytiques.
- Beaucoup de bactéries, les pathogènes notamment, se développent particulièrement bien sur les denrées animales, jus de viande et jaune d’oeuf notamment (protéines).
CONCLUSION
En résumé, pour conserver les aliments, il faut combattre les germes, par 3 approches complémentaires :
1- Eviter la contamination,
2- Tuer les germes, et/ou
3- Inhiber leur développement
Le plus important de ce qui précède c'est que:
1- On peut tuer les bactéries par la chaleur. Savoir expliquer D, z et certaines t°C critiques
2- On peut inhiber les bactéries par le froid. Savoir quelques t°C critiques
3- Les aliments "secs" ou "acides" sont protégés. Savoir quelques aw et pH critiques
Effet combiné des différents paramètres: Synergie des inhibitions.
Théorie des Barrières, ou « haies » : chacun des facteurs de maîtrise du développement microbien peut être considéré comme une "barrière. Les germes, pour se développer, pour arriver au but, doivent "sauter" successivement toutes les "haies". C'est une image, bien sûr, mais l’apposition de plusieurs barrières peut permettre d’éviter la multiplication microbienne: l’effet cumulé de plusieurs facteurs, chacun insuffisant (non inhibiteur pris individuellement), peut permettre de préserver l’aliment
Ainsi, une préparation alimentaire est stabilisée si soit aw ≤ 0.91 (ex.: pain) soit pH ≤ 4.5 (ex.: yogourt) mais aussi si aw < 0.95 et pH < 5.2 (ex.: saucisson)
Interactions entre Micro-Organismes dans l'Aliment (ceci peut être considéré comme facteur exptinsèque)
On distingue, comme pour les interactions entre animaux ou végétaux, différents types d'interactions:
- neutralisme, coopération (croissance favorisée des 2 bactéries en présence) ;
- commensalisme (meilleur développement de A sous l’influence de B) ;
- compétition ou antagonisme (croissance défavorisée des 2 actéries) ;
- amensalisme (B inhibe A sans tirer de profit) ;
- Parasitisme.
Trois exemples d'interactions importantes dans les aliments:
ü Coopération (mutualisme): le yaourt résulte de l'action de 2 ferments lactiques à 40- 45°C. Streptococcus thermophilus produit des facteurs de croissance favorables à Lactobacillus bulgaricus, et vice-versa. Au début de la fermentation, ce sont surtout les "streptos" qui agissent, puis ils laissent progressivement la place aux "lactos", plus résistants en milieu acide. Les 2 germes fermentent donc le lait plus vite et mieux qu'un seul.
ü Compétition (antagonisme) : les microorganismes ont besoin d’un même substrat pour croître. C’est donc le microorganisme le plus rapide au niveau de son métabolisme qui domine. On a ainsi : bactéries > levures > moisissures. En effet, les bactéries sont des procaryotes et se multiplient plus vite que les eucaryotes en conditions optimales (Aw élevé, pH neutre, aliment sucré).
ü Inhibition (amensalisme): Leuconostoc et Lactobacilles synthétisent des bactériocines. Ces protéines, actives surtout contre les Gram-, inhibent les Listeria (G+). Ces interactions jouent un rôle en industrie laitière. Cependant, les industriels n'utilisent actuellement pas de souches spécifiquement sélectionnées sur ce critère (recherches actives aux USA).
Conservateurs / antimicrobiens
Ils peuvent être extrinsèques si on y plonge l'aliment (cerises à l'eau de vie, petit salé"), ou si on les ajoute à l'aliment. Pour certains d'entre eux ils sont aussi intrinsèques lorsqu'ils sont présents naturellement dans l'aliment. Les deux sont présentés ici pour simplifier, minéraux d'abord, puis organiques.
Chlorure de Sodium : NaCl. Un conservateur MAJEUR. L'utilisation du sel sera largement développée dans le cours sur les salaisons. Son effet majeur sur les bactéries est d'inhiber la croissance en diminuant l'activité de l'eau aw
Nitrates et nitrites: Na et K - NO3 et NO2. Utilisés en salaison (E250 max 150 ppm) pour inhiber Clostridium botulinum (germination et croissance) et pour donner avec l'hémoglobine une belle couleur rouge. Utilisé aussi sur certains fromages (Hollande) pour inhiber la germination des clostridies gazogènes qui font exploser ces fromages.
Le mode d'action antibactérien est mal connu. Toxicité mineure (sauf nouveaux-nés) vue ailleurs.
Sulfite de sodium (E220): permet le contrôle de la vinification (inhibe bactéries et moisissures en épargnant les bonnes levures), et ajouté aux fruits secs (pruneaux).
Conservateurs organiques:
Acides organiques.
- Acides gras : acide acétique CH3-COOH et acétates (E260). Conservation des cornichons, des "pickles", marinades (poisson) dans le vinaigre.
- Propionate CH3-CH2-COOH de calcium (E280 antifongique / pâtisseries sous plastique, car sans effet sur levure boulanger).
- Acide sorbique (E200 avec 6 C & 2 =) et acide benzoïque (E210 cycle C6-COOH) inhibent moisissures et levures. Acide ascorbique, citrique (E330) et lactique ajoutés: baisse du pH.
Fermentations: Acide propionique naturel du gruyère anti-moisissures. Acide lactique naturel du yogourt. Acide acétique de la choucroute. Toxicité nulle. Alcools : les produits naturellement fermentés se conservent bien (le vin contient plus de 10% d'alcool et son pH <4).
Les pâtisseries contenant un peu d'alcool (ajouté) ne moisissent pas.
Fumage: traitement par la chaleur et élimination d'eau et dépôt de substances antiseptiques, notamment acides, phénols, et aldéhydes (mais risque de dépôt de cancérigène comme le benzo-a-pyrène si fumage mal conduit)
Sucrage : utilisé dans les confitures. Comme le sel (mais moins fort), le sucre diminue l'activité de l'eau, aw. De plus, la cuisson solubilise la pectine des fruits, qui se solidifie en refroidissant, mais uniquement s'il y a assez de sucre dans le milieu. Le gel ainsi formé limite la dispersion des contaminants et la progression des microbes.
Antibiotiques : en France, interdit d'ajouter un antibiotique dans l'aliment (la Nisine, antibiotique produit par Lactococcus lactis, est ajoutée dans des fromages aux USA pour lutter contre C. perfringens et listeria)
Atmosphères modifiées (voir en fin de poly aspects technologiques)
La conservation sous atmosphère modifiée a pour but de remplacer l'air par des gaz, principalement l'azote et le dioxyde de carbone.
CO2 : agit sur le produit et sur les germes. Avantage: le produit se conserve plus longtemps par inhibition de la croissance microbienne, inactivation des enzymes, et absence d'oxydation des lipides. Presque tous ces aliments oivent être conservés au frais, et sous un emballage imperméable aux gaz, mais le délai de consommation peut atteindre plusieurs semaines.
Effet sur les bactéries
L'emballage sous atmosphère modifiée inhibe les bactéries aérobies en raison de l'absence d'oxygène, et aussi de l'effet bactériostatique du CO2. Cela réduit les pertes d'aliments causées par Pseudomonas sp. et favorise la croissance de bactéries lactiques. Cependant, si cette forme d'emballage parvient très bien à stopper la flore bactérienne aérobie nuisible, les bactéries
anaérobies ou microaérophiles ne sont pas inhibées: Clostridium spp., Campylobacter spp., Listeria monocytogenes. On utilise donc en même temps d'autres moyens bactériostatiques: aw, pH, temps et température de stockage.
Effet sur les lipides
L'emballage sans oxygène empêche de rancir les aliments riches en matières grasses. Dans certains "emballages actifs", des matériaux sont ajoutés afin de modifier la composition des gaz pendant le stockage. Des adsorbants d'oxygène présents dans l'emballage (sachet d'oxyde de fer, par ex.) réduisent le niveau d'oxygène et protègent les graisses.
Maman lire ceci et dite ce que vous en pensez
Comment la congélation tue-t-elle certaines bactéries ?
- les spores résistent très bien, les coques gram+ bien aussi, les bacilles gram– plutôt mal
- les cellules en phase de croissance sont plus sensibles que les cellules en latence
- la destruction se produit au moment où l'eau gèle. Ensuite, le nombre reste stable
- une congélation lente tue plus de bactérie qu'une congélation très rapide (on fait une congélation "flash" dans l'azote liquide pour conserver des souches).
- certaines substances protègent les bactéries = cryoprotecteurs (amidon, sucre, lait, glycérol)
- Ce qui tue (1): Perturbation de la perméabilité par solidification des lipides membranaires
- Ce qui tue (2): Modification de la concentration saline du milieu car les cristaux de glace sont en eau pure. L'eau non gelée contient donc tous les sels et sa pression osmotique monte
- Ce qui tue (3): Action mécanique des cristaux de glace qui écrasent ou percent les cellules.
Des bactéries PATHOGENES qui sont psychrophiles : ils sont quatre :
- Clostridium botulinum E, pousse jusqu'à 3,3°C
- Listeria monocytogenes, 3°C dans l'aliment, et 0°C en milieu de culture, mais très lente
- Yersinia enterocolitica
- Escherichia coli
vendredi 28 août 2009
La PCR
PLAN
Introduction
1- La PCR
1.1- Historique
1.2- Principe
1.3- Les étapes
1.4- Les phases d’un cycle
2- Les différents types de PCR
3- Domaines d’application
4- Avantages et Inconvénients
Conclusion
Introduction
La caractérisation génétique est la description la plus fiable d’une espèce et de l’individu à l’intérieur de l’espèce. Des techniques nouvelles ou améliorée permettent aujourd’hui d’avoir accès à l’information génétique. Ces méthodes les unes plus performantes que les autres se regroupent sous le thème de génie génétique ou de biologie moléculaire. Le génie génétique a connue un essor fabuleux avec l’invention de la PCR. Ainsi cibler un gène, l’amplifier afin d’une utilisation ultérieur sont désormais de routine dans les laboratoires de biologie moléculaire.
L’objet du présent document est de présenter la PCR dans ces différents contours. Il aborde également les différentes variantes de cette technique, ces avantages et inconvénients et les applications que l’on peut en faire.
1- La PCR
La «Polymerase Chain Reaction» ou PCR (ou encore ACP pour Amplification en Chaîne par Polymérase), est une technique de réplication ciblée in vitro.
Elle permet d'obtenir, à partir d'un échantillon complexe et peu abondant, d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur définie. L'ordre de grandeur à retenir est celui du million de copies en quelques heures.
1.1- Historique
1953 : Découverte de la structure en double hélice de l’ADN par James Dewey Watson et Francis Harry Compton Crick, (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1962).
1956 : Découverte de l’ADN polymérase ADN dépendante (ADN pol I) par Arthur Kornberg (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1959).
1970 : Co-découverte indépendante de l’ADN polymérase ARN dépendante par Temin HM et Baltimore D (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1975).
1986 : Première publication publique sur la PCR par Kary Mullis (prix Nobel de chimie en 1993).
1988 : Première PCR réalisée avec une ADN polymérase thermostable, provenant de Thermus aquaticus, par Saiki RK.
1991 : Première détection du produit de PCR par sonde (sonde d’hydrolyse) par Holland PM.
1992 : Invention de la PCR en temps réel par Higuchi R.
1995 : Première publication sur la TAIL-PCR par Liu YG
1996 : Mise au point des polymérases temporairement inactives et activables par la chaleur par Birch DE.
La PCR, méthode de Biologie Moléculaire a été mise au point en 1985 par Kary Mullis [1], la technique connaît un essor considérable à partir de la commercialisation (vers 1988), d'une ADN polymérase résistante aux températures élevées (la Taq polymérase), qui permet une automatisation de la technique [2]. La PCR est une technologie qui a bouleversé la biologie moléculaire. En moins de dix ans, cette technique (maintenant capable de faire plus d'un milliard de copies en moins d'une heure) s'est imposée dans les laboratoires. En revanche, la PCR en temps réel a dû attendre la mise sur le marché d'un certain nombre d'innovations technologiques avant de se développer et est encore considérée comme une méthodologie nouvelle
1.2- Le milieu réactionnel d’une PCR
Ø L’ADN (séquence cible) : La séquence cible représente le segment d'ADN qui sera amplifié (recopié de nombreuses fois). Elle détermine alors le choix du couple d'amorces ;
Ø Les amorces : Le choix des amorces doit tenir compte de plusieurs paramètres en même temps. Les règles basées sur ces paramètres permettent de définir le couple d'amorces le mieux adapté. Elles vont avoir un double rôle : en s'hybridant à l'ADN matrice, elles délimitent la région d’ADN à amplifier (étape 2 du cycle) et avec leur extrémité 3' OH libre servir d’amorce pour l’ADN polymérase ;
Ø L’enzyme (Taq polymérase) : Les ADN polymérases sont des enzymes qui synthétisent l'ADN de l'extrémité 5-prime vers l'extrémité 3-prime. Les polymérases utilisées en PCR sont extraites de bactéries vivant naturellement à des températures élevées comme les sources hydrothermales du fond des océans. Les premières ADN polymérases utilisées provenaient d'une bactérie thermophile (résistante à des températures très élevées), par exemple Thermus aquaticus (Taq polymérase) ou encore Pyrococcus furiosus (Pfu polymérase), Thermococcus litoralis (Vent ou Tli polymérase), Thermus thermophilus (Tth polymérase). De nos jours, les enzymes utilisées sont dites recombinantes, ce qui simplifie considérablement leur obtention, et leurs propriétés ont été largement modifiées pour les rendre plus efficaces, plus fidèles ;
Ø Les oligonucléotides (A, T, G, C)
Ø Autres
Le tampon :
Le tampon utilisé pour la réaction PCR sert à maintenir stable le pH du milieu réactionnel au niveau optimal pour la Taq polymérase (TrisHCl à pH basique 8,5 à 9). Il contient des cations bivalents Mg2+, cofacteurs indispensables pour la réaction de polymérisation avec la Taq polymérase. La présence dans le milieu réactionnel des cations bivalents Mg2+ et de cations monovalents (K+ ou NH4+) vont neutraliser les charges négatives des groupements phosphates au niveau de l’ADN et ainsi stabiliser les hybrides ADN/ADN. En pratique, la concentration en sel doit cependant rester compatible avec l’activité de l’ADN polymérase.
1.3- Principe
Le principe et les conditions expérimentales qui en découlent sont très simples. Il s'agit de réaliser une succession de réactions de réplication d'une matrice double brin d'ADN. Chaque réaction met en oeuvre deux amorces oligonucléotidiques dont les extrémités 3-prime pointent l'une vers l'autre. L'astuce consiste à utiliser les produits de chaque étape de synthèse comme matrices pour les étapes suivantes. Au lieu d'être linéaire, l'amplification obtenue est exponentielle.
1.4- Les phases d’un cycle
A température ambiante L’ADN bicaténaire adopte sa conformation en double hélice. Dans le schéma qui suit, nous considérerons qu’il n’y a qu’une molécule initiale d’ADN double brin dans la solution, la zone colorée (rose et orange) correspondant à notre amplicon (voir schéma sur page 8).
Chaque cycle de PCR est constitué de trois phases différentes à trois températures différentes : la dénaturation, l'hybridation (ou annelage) et l'élongation (ou extension des amorces).
La dénaturation (1 sur le schéma) : Le thermomètre indique que le tube est à la température de 95°C. A cette température, les liaisons faibles (triple entre C et G et double entre A et T) qui assuraient la cohésion de la double hélice d'ADN sont rompues pour donner deux simples brins d'ADN.
L’Hybridation (2 sur le schéma) : L’hybridation des amorces sur l'ADN repose sur le principe de l'appariement des bases complémentaires. Les amorces de taille très inférieure aux brins initiaux présentent une probabilité de « rencontre » avec les matrices plus élevée que celle des brins matrice entre elles.
Le choix de la température d'hybridation résulte d'un compromis entre plusieurs paramètres. Elle est calculée en fonction de la longueur et de la séquence des amorces. Elle est légèrement inférieure (environ de 5°C) au Tm qui est la température de demi-dénaturation. Pour calculer le Tm d’un oligonucléotide inférieur à 30 nucléotides, on utilise la relation suivante :
Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)
La température d'hybridation est, de toute façon, inférieure à la température de dénaturation et est comprise entre 40 et 65°C [2]
L’Elongation (3 sur le schéma) : la température es maintenu à 72°C Les amorces hybridées à l'ADN servent de point de départ (comme leur nom l'indique), à la polymérisation du brin d'ADN complémentaire de l'ADN matrice. La polymérisation se fait dans le sens 5’…3’ par ajout successif des désoxyribonucléotides (présents dans le mélange en large excès). Chaque base ajoutée est complémentaire de la base correspondante du brin matrice.
Remarquons que la polymérisation ne s'arrête pas lorsque la copie est de la longueur souhaitée. La copie de l'ADN initial génère donc des copies plus longues que souhaitées. Aussi les brins nouvellement synthétisés, sont limités à leur extrémité 5-prime par l'amorce. Au contraire leur extrémité 3-prime est éventuellement plus longue car la Taq polymérase poursuit généralement au delà de la longueur souhaitée.
L'extension des amorces à partir de l'ADN initialement présent dans le tube produit donc des brins d'ADN d'une longueur indéterminée, souvent appelés « brins longs ».
Comme leur accumulation dans le tube se fait de façon linéaire, leur quantité finale est directement proportionnelle au nombre de cycles réalisés [2]. Elles augmentent de manière linéaire (de 1 par cycle sauf si l’ADN natif se dégrade).
C’est en fin du 3ème cycle qu’apparaissent les deux premiers exemplaires du fragment recherché qui font l’objet de la PCR.
A la fin de chaque cycle la quantité d’ADN cible est doublée. Chaque brin servira à son tour de matrice pendant le cycle suivant. Après n cycle la quantité d’ADN est égale à 2n.
Evolution de la température et des différents types de brins d'ADN au cours des 4 premiers cycles de la PCR
2- Les différents types de PCR
Il existe diverses techniques associées à la PCR. Nous pouvons distinguer :
2.1- PCR multiplexe
La PCR multiplexe (multiplex PCR) est un protocole destiné à amplifier plus d’un amplicon à la fois, par l'utilisation d'au moins trois amorces par réaction de PCR. Les produits de PCR ne seront alors compétitifs que pour la polymérase, les dNTP et, éventuellement, le marqueur d’ADN. Il est également possible d’amplifier différents types d’ADN reconnus par un même couple d’amorces, tels les mimics. La PCR multiplexe peut se faire en point final (les produits de PCR étant usuellement différenciés par leur taille ou la présence d’un site de restriction) ou en temps réel (chaque produit étant mesuré par une sonde spécifique couplée à un fluorophore dont le spectre d’émission est différent des autres). Ses applications qualitatives sont nombreuses (détection de souche virale, de mutations, …) mais son aspect quantitatif ne fait pas l’unanimité.
2.2- Méta-PCR
La Meta-PCR est une méthode qui permet de donner une molécule d'ADN synthétique comprenant n'importe quelle combinaison d'ADN amplifiable par PCR dans n'importe quel ordre. Elle est effectuée dans un seul tube et se compose de deux différentes étapes de la PCR séparées par un cycle de dégel pour éliminer l'activité résiduelle de la polymérase. La Meta-PCR peut être utilisée pour accroître le débit des méthodes de numérisation et balayage des mutations.
2.3- PCR emboîtée
La PCR emboîtée, PCR gigogne ou PCR nichée (Nested PCR) est une PCR en deux étapes successives, avec deux couples d’amorce différents, le second liant des séquences situées à l’intérieur du premier amplicon. Cette technique était initialement utilisée pour réduire le risque de contamination (le produit final devait pouvoir interagir avec deux couples d’amorces, donc deux niveaux de spécificité). Elle est maintenant très utilisée par les virologues travaillant sur les virus à ARN qui peuvent avoir une haute mutabilité. Le premier couple d’amorces est conçu pour pouvoir accrocher les quelques parties stables du génome viral, le deuxième pour identifier le sous-type. Elle permet aussi une meilleure sensibilité du résultat.
2.4- PCR asymétrique
C'est l'amplification par PCR en présence d'une faible quantité d'une des amorces. Elle permet le séquençage direct des fragments amplifiés. Pendant les 20 à 25 premiers cycles, l'ADN double brin est généré, jusqu'à épuisement de l'amorce limitante et de l'ADN simple brin est produit pendant les 5 à 10 derniers cycles. Les rapports d'amorces utilisés sont de 50 pmole/1-5 pmoles/100 µL (1-3 pmoles simple brin après 30 cycles).
2.5- PCR à asymétrique thermique entrelacée
La PCR à asymétrique thermique entrelacée (TAIL-PCR ou Thermal asymmetric interlaced PCR) est un protocole complexe alliant les principes de la PCR emboîtée, de la PCR asymétrique par le Tm des amorces, la succession de plusieurs types de cycle favorisant l’hybridation de telle ou telle amorce, et des amorces dégénérées. Le but est d’obtenir un amplicon final spécifique d’une séquence d’ADN dont seule une extrémité est connue généralement dans l’optique de séquencer la partie inconnue. Cette méthode est très utilisée pour la marche sur chromosome ou la caractérisation des séquences variables des immunoglobulines.
2.6- PCR en gradient de température
Il s’agit d’une technique aidant à la mise au point d’un nouveau protocole de PCR. Elle nécessite des thermocycleurs capables d’assurer des températures différentes, pour une même étape, aux différents échantillons. Elle est surtout utilisée pour optimiser l’étape d’hybridation, notamment en PCR multiplexe.
2.7- PCR en temps réel ou PCR quantitative
La PCR en temps réel (Real-time PCR) est une révolution dans l’utilisation de la PCR, cette technique consiste à mesurer la quantité d’ADN polymérisé à chaque cycle (temps réel) grâce à un marqueur fluorescent. Elle permet par son principe de faire des mesures quantitatives (expliquant l'appellation PCR quantitative, qPCR) mais elle nécessite des thermocycleurs particuliers. Il ne faut surtout pas la confondre avec la RT-PCR (Reverse Transcription PCR), on préférera donc les appellations PCR quantitative ou qPCR. Certaines expériences en PCR compétitive ou PCR radioactive permettent l'obtention de mesure quantitative exploitable.
2.8- PCR en point final
La PCR en point final (end point PCR) est un terme qui est apparu en opposition à la PCR en temps réel. Il désigne toutes les tentatives de quantification à partir du produit final d’une réaction de PCR.
2.9- PCR par essais
La PCR par essais (Touchdown PCR) est un protocole utilisé pour amplifier de l'ADN faiblement représenté et/ou subissant une compétition sur leurs amorces par des produits de pseudo-gène. Il consiste à avoir une température d’hybridation très haute lors des premiers cycles afin d’assurer une forte stringence et donc une amplification spécifique. Une fois que la séquence d'intérêt devient majoritaire vis-à-vis de ses compétiteurs, la température d’hybridation est progressivement abaissée afin d’assurer une meilleure efficacité de PCR. L’efficacité n’étant pas constante tout au long de la réaction, il est très difficile (impossible ?) de pouvoir obtenir un résultat quantitatif sans biais.
2.10- PCR sur colonie
La PCR sur colonie (Colony PCR) est un protocole qui permet d'amplifier de façon simple de l'ADN de micro-organisme (bactéries, archées ou levures) en inoculant directement la colonie dans le milieu réactionnel de la PCR. Durant les premières étapes de dénaturation, les cellules sont lysées et leur ADN est libéré dans le milieu réactionnel. L'ADN ainsi libéré peut alors servir de matrice.
La PCR sur colonie est utilisée notamment pour vérifier l'efficacité d'une transgénèse. Elle fut très utilisée lors de la construction des BAC dans les grands programmes de séquençage.
La PCR sur colonie est largement utilisée en recherche microbiologique afin de caractériser sur le plan phylogénétique les souches étudiées.
2.11- RT-PCR
La RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) est une technique qui associe une transcription inverse (RT) suivie d’une PCR. Elle permet de synthétiser le brin complémentaire d’un ARN avec des désoxyribonucléotides en utilisant une ADN polymérase ARN dépendante (transcriptase inverse). Cet ADNc est généralement destiné à être amplifié par PCR (l'ADNc étant plus stable, il permet plus de liberté que les ARN pour les analyses suivantes). Il existe plusieurs variantes de la RT - PCR
RT-PCR en une étape
La RT-PCR en une étape (single step RT-PCR) est un protocole mélangeant les réactifs de RT et de PCR afin que les deux étapes puissent se faire sans avoir à ouvrir le tube. Cela permet de réduire le risque de contamination ou d’inversion d’échantillon mais il est plus difficile d’optimiser le milieu réactionnel pour chaque étape. Cela induit en outre un risque de biais pour normaliser l’étape de RT car cela implique d'utiliser la PCR multiplexe.
RT-PCR in situ
La RT-PCR in situ est une méthodologie consiste à réaliser la RT-PCR non pas sur des molécules en solution mais sur des coupes histologiques. Bien que les résultats ne soient que semi-quantitatifs, ils apportent en outre une information sur la localisation des transcrits dans le tissu.
RT-PCR quantitative
La RT-PCR quantitative (qRT-PCR) est une technique destinée à pouvoir quantifier un type d’ARN initialement présent dans un échantillon. Ce terme désigne l'utilisation de deux techniques successivement, une Transcription inverse suivie d’une PCR en temps réel. Objectif principal de la plupart des biologistes, elle soulève de vives polémiques quant à l’utilisation de calibrateur externe ou interne (gène de ménage). À l’exception de complexes protocoles utilisant des calibrateurs externes homologues compétitifs, elle ne permet qu’une quantification relative.
RT-PCR sur une cellule
La RT-PCR sur une cellule (single-cell RT-PCR) est une méthodologie qui permet d’étudier les transcrits d’une cellule unique, obtenue par patch-clamp, microdissection laser ou triage de cellules par activité de fluorescence (FACS en anglais pour Fluorescence activated cell sorting). Cette précision peut être nécessaire lorsque le tissu n’est pas homogène (cellules tumorales, feuillets cellulaires bien différenciés, etc.) mais la quantification va devenir moins précise à cause d’une amplification des effets stochastiques et nécessite donc une multiplication des mesures.
2.12- PAN-AC
Une autre technique d'amplification isotherme : "Polymérisation des Acides Nucléiques pour Apoptose Controlée". Les auteurs prétendent que cette technique pourrait être mise en oeuvre dans des cellules vivantes, et ainsi soigner diverses pathologies (HIV, Malaria, cancers...)[] mais ces affirmations n'ont été corroborées par aucune autre équipe pour le moment.
2.13- TP-PCR
La TP-PCR (TP pour Triplet Repeat primed), une variante complexe de la PCR, a été mise au point par Jon Warner en 1996 et est utilisée dans les amplifications des gènes comportant des triplets répétés, comme dans le cas de la Dystrophie myotonique de Steinert. La combinaison PCR-Séquençage ne peut pas être utilisée dans ces cas car la Taq polymérase fait des erreurs de réplication.
3- Domaines d’application
Les applications sont trop nombreuses pour être toutes citées. Elles consistent toujours à rendre décelable, et de ce fait analysable, de l'ADN, souvent présent à l'état de traces.
Ø Dans le diagnostic bactériologique virologie
- Détection et quantification de microorganismes
- Caractérisation génomique
La technique de PCR est a priori :
- très sensible ; elle peut dans certains cas s'appliquer directement à l'échantillon à analyser, supprimant ainsi les délais de mise en culture et les problèmes liés aux germes non cultivables ;
- très spécifique ; elle reste (et cela peut, par contre, être considéré comme inconvénient), une démarche orientée, pour le moment disponible pour un nombre restreint de microorganismes ;
- beaucoup plus rapide et automatisable.
Ø Dans le domaine de la santé
Technique de biologie moléculaire de haute sensibilité qui permet de détecter dans le sang et dans les tissus des fragments d’ADN et d’ARN de virus, de bactéries ou autres micro-organismes en les recopiant presque à l’infini. C’est cette technique et ses variantes qui servent à la recherche qualitative et quantitative des virus des hépatites B et C ainsi que du VIH. La PCR a permis le développement de tests ultra-sensibles pour le VIH et le VHC, grâce auxquels le diagnostic précoce de ces infections est possible, avant l’apparition des anticorps spécifiques de chacune d’elles. Elle est indispensable dans le domaine de la transfusion sanguine.
La recherche d'une pathologie
Recherche de parasites (ex : toxoplasmose), de bactéries (ex : tuberculose), de virus (ex : HIV), d'oncogènes (gènes impliqué dans la cancérogenèse, ex : papillomavirus) ou de translocations (ex : leucémie myéloïde chronique). On met en évidence l'absence, ou la présence, dans le prélèvement d'un fragment d'ADN spécifique de l'agent causal.
Le diagnostic anténatal
Identification sur un gène d'une mutation connue et identifiée (ex : mucoviscidose) ou d'une délétion (ex : myopathie de Duchenne), responsables et caractéristiques de la maladie recherchée.
Ø Le clonage acellulaire [4]
C’est l’une des applications les plus remarquables de la PCR. Elle permet d’isoler, c’est-à-dire de purifier un gène sans recourir aux méthodes traditionnelles de clonage moléculaire qui consistent à insérer une banque d’ADN dans un vecteur plasmidique qui est ensuite employé à transformer une souche bactérienne dont les clones, après sélection, sont criblés. La réalisation est beaucoup plus rapide et beaucoup moins aléatoire en utilisant la PCR.
On parle de clonage acellulaire, lorsqu’on utilise la PCR, car il est inutile d’employer un système cellulaire (bactérie, levure, cellule animale ou végétale) pour amplifier le clone.
Plusieurs cas de figure se présentent :
1/ La séquence du gène est connue ;
2/ La séquence du gène n’est pas connue, mais il appartient à une famille dont plusieurs membres ont déjà été clonés et séquencés, et dont on peut déduire par comparaison des séquences très conservées au sein de la famille ;
3/ La séquence n’est pas connue, mais le gène a déjà été cloné et séquencé chez d’autres espèces d’où l’on peut déduire des séquences homologues entre espèces ;
4/ La séquence du gène n’est pas connue, mais la protéine qui lui correspond a été purifiée et séquencée et l’on peut déduire une séquence nucléotidique dégénérée à partir de la séquence aminoacide (génétique inverse), ce cas peut se combiner avec les deux précédents ;
5/ Le gène et la protéine qui lui correspond sont inconnus.
Le cas (1) ne présente pas de difficulté, la connaissance des séquences permet de synthétiser les jeux d’amorces nécessaires à l’amplification.
Dans les cas (2) et (3), la difficulté augmente à cause des incertitudes en matière de séquence. Toutefois, les homologies sont assez fiables pour permettre de produire des jeux d’amorces performants à condition bien sûr que les espèces ne soient pas trop éloignées, ou que la famille du gène d’intérêt ne soit pas trop hétéromorphe. Le cas (4) peut poser des problèmes importants notamment dans la mesure où les séquences protéiques à partir desquelles les amorces sont déduites contiennent des aminoacides très dégénérés. Le cas (5) est quasiment désespéré.
Ø Autres
1- Détection de polymorphismes
- polymorphisme de restriction
- marqueurs microsatellites
2 - Médecine légale, Criminologie…
3 – Diagnostic des maladies héréditaires
4 – Séquençage
4- Avantages et Inconvénients
4.1- Avantages
La PCR est une technique très sensible car capable de générer une très grande quantité d’acide nucléique a partir de quelques copie de la séquence recherché.
- Sensibilité
• Faible quantité de matériel initial : à partir de quantité infinitésimale on produit une grande quantité de matériel génétique.
• Gain de temps / sérologie : la PCR permet en peu de temps d’identifier les différents types viraux présent
- Rapidité
• Gain de temps / culture : élimination des temps de cultures et d’incubation.
• Réponse extrêmement rapide
- Spécificité
• Discrimination
4.2- inconvénients [5]
La PCR reste une technique parfois délicate à réaliser et à interprété du faite
- des risques d’inter contamination lors des prélèvements sur les animaux ;
- de la possible dégradation des acides nucléiques en particulier de l’ARN ainsi que de la présence d’inhibiteurs de PCR lors de certains prélèvements ;
- de la contamination facile du milieu réactionnel lors de l’analyse au laboratoire ;
Ø Problèmes de contamination
- Donne des faux positifs.
- Dû à la sensibilité extrême de la technique
- Contamination par aérosols de produits PCR (Après amplification : 200 copies/pL or 1 aérosol = 1 pL)
Pour contrôler la contamination :
- Nécessité de contrôle négatif, sans ADN cible (témoin)
- Organisation du laboratoire (pièces pré-PCR, PCR, post-PCR)
avec matériel dédié et circulation mono-directionnelle
- Utilisation de pointes-filtres
- Aliquotage des réactifs
Ø Problème de la présence d’inhibiteurs
- Donne des faux négatifs.
- Certains sont connus (hème, DMSO, héparine, SDS, colorants, phénols…).
- D’autres inconnus (dans LCR, urines)
-Nécessité de contrôle positif ajouté dans l’échantillon (autre cible ou même cible modifiée)
- Pour lever l’inhibition :
* Diluer l’échantillon
* Purifier l’ADN
Conclusion
La PCR est technique intéressante et performante de laboratoire à pratiquer sous assurance qualité totale (locaux, matériels, consommables, procédure de travail).
Elle peut être mise en œuvre en compléments des autres méthodes de diagnostiques disponibles.
Référence bibliographique
[1] : http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/index.htm consulté le 09/05/09
[2] : http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm consulté le 09/05/09
[3] : http://fr.wikipedia.org/wiki/Réaction_en_chaîne_par_polymérase#Historique consulté le 09/05/09
[4] : http://www.congres-des-sciences.be/archives/2006/DOC-Siatka.pdf
[5] : http://www.med.univ-rennes1.fr/wkf/stock/RENNES20071031101610vdavidPCR_2007.pdf
Introduction
1- La PCR
1.1- Historique
1.2- Principe
1.3- Les étapes
1.4- Les phases d’un cycle
2- Les différents types de PCR
3- Domaines d’application
4- Avantages et Inconvénients
Conclusion
Introduction
La caractérisation génétique est la description la plus fiable d’une espèce et de l’individu à l’intérieur de l’espèce. Des techniques nouvelles ou améliorée permettent aujourd’hui d’avoir accès à l’information génétique. Ces méthodes les unes plus performantes que les autres se regroupent sous le thème de génie génétique ou de biologie moléculaire. Le génie génétique a connue un essor fabuleux avec l’invention de la PCR. Ainsi cibler un gène, l’amplifier afin d’une utilisation ultérieur sont désormais de routine dans les laboratoires de biologie moléculaire.
L’objet du présent document est de présenter la PCR dans ces différents contours. Il aborde également les différentes variantes de cette technique, ces avantages et inconvénients et les applications que l’on peut en faire.
1- La PCR
La «Polymerase Chain Reaction» ou PCR (ou encore ACP pour Amplification en Chaîne par Polymérase), est une technique de réplication ciblée in vitro.
Elle permet d'obtenir, à partir d'un échantillon complexe et peu abondant, d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur définie. L'ordre de grandeur à retenir est celui du million de copies en quelques heures.
1.1- Historique
1953 : Découverte de la structure en double hélice de l’ADN par James Dewey Watson et Francis Harry Compton Crick, (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1962).
1956 : Découverte de l’ADN polymérase ADN dépendante (ADN pol I) par Arthur Kornberg (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1959).
1970 : Co-découverte indépendante de l’ADN polymérase ARN dépendante par Temin HM et Baltimore D (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1975).
1986 : Première publication publique sur la PCR par Kary Mullis (prix Nobel de chimie en 1993).
1988 : Première PCR réalisée avec une ADN polymérase thermostable, provenant de Thermus aquaticus, par Saiki RK.
1991 : Première détection du produit de PCR par sonde (sonde d’hydrolyse) par Holland PM.
1992 : Invention de la PCR en temps réel par Higuchi R.
1995 : Première publication sur la TAIL-PCR par Liu YG
1996 : Mise au point des polymérases temporairement inactives et activables par la chaleur par Birch DE.
La PCR, méthode de Biologie Moléculaire a été mise au point en 1985 par Kary Mullis [1], la technique connaît un essor considérable à partir de la commercialisation (vers 1988), d'une ADN polymérase résistante aux températures élevées (la Taq polymérase), qui permet une automatisation de la technique [2]. La PCR est une technologie qui a bouleversé la biologie moléculaire. En moins de dix ans, cette technique (maintenant capable de faire plus d'un milliard de copies en moins d'une heure) s'est imposée dans les laboratoires. En revanche, la PCR en temps réel a dû attendre la mise sur le marché d'un certain nombre d'innovations technologiques avant de se développer et est encore considérée comme une méthodologie nouvelle
1.2- Le milieu réactionnel d’une PCR
Ø L’ADN (séquence cible) : La séquence cible représente le segment d'ADN qui sera amplifié (recopié de nombreuses fois). Elle détermine alors le choix du couple d'amorces ;
Ø Les amorces : Le choix des amorces doit tenir compte de plusieurs paramètres en même temps. Les règles basées sur ces paramètres permettent de définir le couple d'amorces le mieux adapté. Elles vont avoir un double rôle : en s'hybridant à l'ADN matrice, elles délimitent la région d’ADN à amplifier (étape 2 du cycle) et avec leur extrémité 3' OH libre servir d’amorce pour l’ADN polymérase ;
Ø L’enzyme (Taq polymérase) : Les ADN polymérases sont des enzymes qui synthétisent l'ADN de l'extrémité 5-prime vers l'extrémité 3-prime. Les polymérases utilisées en PCR sont extraites de bactéries vivant naturellement à des températures élevées comme les sources hydrothermales du fond des océans. Les premières ADN polymérases utilisées provenaient d'une bactérie thermophile (résistante à des températures très élevées), par exemple Thermus aquaticus (Taq polymérase) ou encore Pyrococcus furiosus (Pfu polymérase), Thermococcus litoralis (Vent ou Tli polymérase), Thermus thermophilus (Tth polymérase). De nos jours, les enzymes utilisées sont dites recombinantes, ce qui simplifie considérablement leur obtention, et leurs propriétés ont été largement modifiées pour les rendre plus efficaces, plus fidèles ;
Ø Les oligonucléotides (A, T, G, C)
Ø Autres
Le tampon :
Le tampon utilisé pour la réaction PCR sert à maintenir stable le pH du milieu réactionnel au niveau optimal pour la Taq polymérase (TrisHCl à pH basique 8,5 à 9). Il contient des cations bivalents Mg2+, cofacteurs indispensables pour la réaction de polymérisation avec la Taq polymérase. La présence dans le milieu réactionnel des cations bivalents Mg2+ et de cations monovalents (K+ ou NH4+) vont neutraliser les charges négatives des groupements phosphates au niveau de l’ADN et ainsi stabiliser les hybrides ADN/ADN. En pratique, la concentration en sel doit cependant rester compatible avec l’activité de l’ADN polymérase.
1.3- Principe
Le principe et les conditions expérimentales qui en découlent sont très simples. Il s'agit de réaliser une succession de réactions de réplication d'une matrice double brin d'ADN. Chaque réaction met en oeuvre deux amorces oligonucléotidiques dont les extrémités 3-prime pointent l'une vers l'autre. L'astuce consiste à utiliser les produits de chaque étape de synthèse comme matrices pour les étapes suivantes. Au lieu d'être linéaire, l'amplification obtenue est exponentielle.
1.4- Les phases d’un cycle
A température ambiante L’ADN bicaténaire adopte sa conformation en double hélice. Dans le schéma qui suit, nous considérerons qu’il n’y a qu’une molécule initiale d’ADN double brin dans la solution, la zone colorée (rose et orange) correspondant à notre amplicon (voir schéma sur page 8).
Chaque cycle de PCR est constitué de trois phases différentes à trois températures différentes : la dénaturation, l'hybridation (ou annelage) et l'élongation (ou extension des amorces).
La dénaturation (1 sur le schéma) : Le thermomètre indique que le tube est à la température de 95°C. A cette température, les liaisons faibles (triple entre C et G et double entre A et T) qui assuraient la cohésion de la double hélice d'ADN sont rompues pour donner deux simples brins d'ADN.
L’Hybridation (2 sur le schéma) : L’hybridation des amorces sur l'ADN repose sur le principe de l'appariement des bases complémentaires. Les amorces de taille très inférieure aux brins initiaux présentent une probabilité de « rencontre » avec les matrices plus élevée que celle des brins matrice entre elles.
Le choix de la température d'hybridation résulte d'un compromis entre plusieurs paramètres. Elle est calculée en fonction de la longueur et de la séquence des amorces. Elle est légèrement inférieure (environ de 5°C) au Tm qui est la température de demi-dénaturation. Pour calculer le Tm d’un oligonucléotide inférieur à 30 nucléotides, on utilise la relation suivante :
Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)
La température d'hybridation est, de toute façon, inférieure à la température de dénaturation et est comprise entre 40 et 65°C [2]
L’Elongation (3 sur le schéma) : la température es maintenu à 72°C Les amorces hybridées à l'ADN servent de point de départ (comme leur nom l'indique), à la polymérisation du brin d'ADN complémentaire de l'ADN matrice. La polymérisation se fait dans le sens 5’…3’ par ajout successif des désoxyribonucléotides (présents dans le mélange en large excès). Chaque base ajoutée est complémentaire de la base correspondante du brin matrice.
Remarquons que la polymérisation ne s'arrête pas lorsque la copie est de la longueur souhaitée. La copie de l'ADN initial génère donc des copies plus longues que souhaitées. Aussi les brins nouvellement synthétisés, sont limités à leur extrémité 5-prime par l'amorce. Au contraire leur extrémité 3-prime est éventuellement plus longue car la Taq polymérase poursuit généralement au delà de la longueur souhaitée.
L'extension des amorces à partir de l'ADN initialement présent dans le tube produit donc des brins d'ADN d'une longueur indéterminée, souvent appelés « brins longs ».
Comme leur accumulation dans le tube se fait de façon linéaire, leur quantité finale est directement proportionnelle au nombre de cycles réalisés [2]. Elles augmentent de manière linéaire (de 1 par cycle sauf si l’ADN natif se dégrade).
C’est en fin du 3ème cycle qu’apparaissent les deux premiers exemplaires du fragment recherché qui font l’objet de la PCR.
A la fin de chaque cycle la quantité d’ADN cible est doublée. Chaque brin servira à son tour de matrice pendant le cycle suivant. Après n cycle la quantité d’ADN est égale à 2n.
Evolution de la température et des différents types de brins d'ADN au cours des 4 premiers cycles de la PCR
2- Les différents types de PCR
Il existe diverses techniques associées à la PCR. Nous pouvons distinguer :
2.1- PCR multiplexe
La PCR multiplexe (multiplex PCR) est un protocole destiné à amplifier plus d’un amplicon à la fois, par l'utilisation d'au moins trois amorces par réaction de PCR. Les produits de PCR ne seront alors compétitifs que pour la polymérase, les dNTP et, éventuellement, le marqueur d’ADN. Il est également possible d’amplifier différents types d’ADN reconnus par un même couple d’amorces, tels les mimics. La PCR multiplexe peut se faire en point final (les produits de PCR étant usuellement différenciés par leur taille ou la présence d’un site de restriction) ou en temps réel (chaque produit étant mesuré par une sonde spécifique couplée à un fluorophore dont le spectre d’émission est différent des autres). Ses applications qualitatives sont nombreuses (détection de souche virale, de mutations, …) mais son aspect quantitatif ne fait pas l’unanimité.
2.2- Méta-PCR
La Meta-PCR est une méthode qui permet de donner une molécule d'ADN synthétique comprenant n'importe quelle combinaison d'ADN amplifiable par PCR dans n'importe quel ordre. Elle est effectuée dans un seul tube et se compose de deux différentes étapes de la PCR séparées par un cycle de dégel pour éliminer l'activité résiduelle de la polymérase. La Meta-PCR peut être utilisée pour accroître le débit des méthodes de numérisation et balayage des mutations.
2.3- PCR emboîtée
La PCR emboîtée, PCR gigogne ou PCR nichée (Nested PCR) est une PCR en deux étapes successives, avec deux couples d’amorce différents, le second liant des séquences situées à l’intérieur du premier amplicon. Cette technique était initialement utilisée pour réduire le risque de contamination (le produit final devait pouvoir interagir avec deux couples d’amorces, donc deux niveaux de spécificité). Elle est maintenant très utilisée par les virologues travaillant sur les virus à ARN qui peuvent avoir une haute mutabilité. Le premier couple d’amorces est conçu pour pouvoir accrocher les quelques parties stables du génome viral, le deuxième pour identifier le sous-type. Elle permet aussi une meilleure sensibilité du résultat.
2.4- PCR asymétrique
C'est l'amplification par PCR en présence d'une faible quantité d'une des amorces. Elle permet le séquençage direct des fragments amplifiés. Pendant les 20 à 25 premiers cycles, l'ADN double brin est généré, jusqu'à épuisement de l'amorce limitante et de l'ADN simple brin est produit pendant les 5 à 10 derniers cycles. Les rapports d'amorces utilisés sont de 50 pmole/1-5 pmoles/100 µL (1-3 pmoles simple brin après 30 cycles).
2.5- PCR à asymétrique thermique entrelacée
La PCR à asymétrique thermique entrelacée (TAIL-PCR ou Thermal asymmetric interlaced PCR) est un protocole complexe alliant les principes de la PCR emboîtée, de la PCR asymétrique par le Tm des amorces, la succession de plusieurs types de cycle favorisant l’hybridation de telle ou telle amorce, et des amorces dégénérées. Le but est d’obtenir un amplicon final spécifique d’une séquence d’ADN dont seule une extrémité est connue généralement dans l’optique de séquencer la partie inconnue. Cette méthode est très utilisée pour la marche sur chromosome ou la caractérisation des séquences variables des immunoglobulines.
2.6- PCR en gradient de température
Il s’agit d’une technique aidant à la mise au point d’un nouveau protocole de PCR. Elle nécessite des thermocycleurs capables d’assurer des températures différentes, pour une même étape, aux différents échantillons. Elle est surtout utilisée pour optimiser l’étape d’hybridation, notamment en PCR multiplexe.
2.7- PCR en temps réel ou PCR quantitative
La PCR en temps réel (Real-time PCR) est une révolution dans l’utilisation de la PCR, cette technique consiste à mesurer la quantité d’ADN polymérisé à chaque cycle (temps réel) grâce à un marqueur fluorescent. Elle permet par son principe de faire des mesures quantitatives (expliquant l'appellation PCR quantitative, qPCR) mais elle nécessite des thermocycleurs particuliers. Il ne faut surtout pas la confondre avec la RT-PCR (Reverse Transcription PCR), on préférera donc les appellations PCR quantitative ou qPCR. Certaines expériences en PCR compétitive ou PCR radioactive permettent l'obtention de mesure quantitative exploitable.
2.8- PCR en point final
La PCR en point final (end point PCR) est un terme qui est apparu en opposition à la PCR en temps réel. Il désigne toutes les tentatives de quantification à partir du produit final d’une réaction de PCR.
2.9- PCR par essais
La PCR par essais (Touchdown PCR) est un protocole utilisé pour amplifier de l'ADN faiblement représenté et/ou subissant une compétition sur leurs amorces par des produits de pseudo-gène. Il consiste à avoir une température d’hybridation très haute lors des premiers cycles afin d’assurer une forte stringence et donc une amplification spécifique. Une fois que la séquence d'intérêt devient majoritaire vis-à-vis de ses compétiteurs, la température d’hybridation est progressivement abaissée afin d’assurer une meilleure efficacité de PCR. L’efficacité n’étant pas constante tout au long de la réaction, il est très difficile (impossible ?) de pouvoir obtenir un résultat quantitatif sans biais.
2.10- PCR sur colonie
La PCR sur colonie (Colony PCR) est un protocole qui permet d'amplifier de façon simple de l'ADN de micro-organisme (bactéries, archées ou levures) en inoculant directement la colonie dans le milieu réactionnel de la PCR. Durant les premières étapes de dénaturation, les cellules sont lysées et leur ADN est libéré dans le milieu réactionnel. L'ADN ainsi libéré peut alors servir de matrice.
La PCR sur colonie est utilisée notamment pour vérifier l'efficacité d'une transgénèse. Elle fut très utilisée lors de la construction des BAC dans les grands programmes de séquençage.
La PCR sur colonie est largement utilisée en recherche microbiologique afin de caractériser sur le plan phylogénétique les souches étudiées.
2.11- RT-PCR
La RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) est une technique qui associe une transcription inverse (RT) suivie d’une PCR. Elle permet de synthétiser le brin complémentaire d’un ARN avec des désoxyribonucléotides en utilisant une ADN polymérase ARN dépendante (transcriptase inverse). Cet ADNc est généralement destiné à être amplifié par PCR (l'ADNc étant plus stable, il permet plus de liberté que les ARN pour les analyses suivantes). Il existe plusieurs variantes de la RT - PCR
RT-PCR en une étape
La RT-PCR en une étape (single step RT-PCR) est un protocole mélangeant les réactifs de RT et de PCR afin que les deux étapes puissent se faire sans avoir à ouvrir le tube. Cela permet de réduire le risque de contamination ou d’inversion d’échantillon mais il est plus difficile d’optimiser le milieu réactionnel pour chaque étape. Cela induit en outre un risque de biais pour normaliser l’étape de RT car cela implique d'utiliser la PCR multiplexe.
RT-PCR in situ
La RT-PCR in situ est une méthodologie consiste à réaliser la RT-PCR non pas sur des molécules en solution mais sur des coupes histologiques. Bien que les résultats ne soient que semi-quantitatifs, ils apportent en outre une information sur la localisation des transcrits dans le tissu.
RT-PCR quantitative
La RT-PCR quantitative (qRT-PCR) est une technique destinée à pouvoir quantifier un type d’ARN initialement présent dans un échantillon. Ce terme désigne l'utilisation de deux techniques successivement, une Transcription inverse suivie d’une PCR en temps réel. Objectif principal de la plupart des biologistes, elle soulève de vives polémiques quant à l’utilisation de calibrateur externe ou interne (gène de ménage). À l’exception de complexes protocoles utilisant des calibrateurs externes homologues compétitifs, elle ne permet qu’une quantification relative.
RT-PCR sur une cellule
La RT-PCR sur une cellule (single-cell RT-PCR) est une méthodologie qui permet d’étudier les transcrits d’une cellule unique, obtenue par patch-clamp, microdissection laser ou triage de cellules par activité de fluorescence (FACS en anglais pour Fluorescence activated cell sorting). Cette précision peut être nécessaire lorsque le tissu n’est pas homogène (cellules tumorales, feuillets cellulaires bien différenciés, etc.) mais la quantification va devenir moins précise à cause d’une amplification des effets stochastiques et nécessite donc une multiplication des mesures.
2.12- PAN-AC
Une autre technique d'amplification isotherme : "Polymérisation des Acides Nucléiques pour Apoptose Controlée". Les auteurs prétendent que cette technique pourrait être mise en oeuvre dans des cellules vivantes, et ainsi soigner diverses pathologies (HIV, Malaria, cancers...)[] mais ces affirmations n'ont été corroborées par aucune autre équipe pour le moment.
2.13- TP-PCR
La TP-PCR (TP pour Triplet Repeat primed), une variante complexe de la PCR, a été mise au point par Jon Warner en 1996 et est utilisée dans les amplifications des gènes comportant des triplets répétés, comme dans le cas de la Dystrophie myotonique de Steinert. La combinaison PCR-Séquençage ne peut pas être utilisée dans ces cas car la Taq polymérase fait des erreurs de réplication.
3- Domaines d’application
Les applications sont trop nombreuses pour être toutes citées. Elles consistent toujours à rendre décelable, et de ce fait analysable, de l'ADN, souvent présent à l'état de traces.
Ø Dans le diagnostic bactériologique virologie
- Détection et quantification de microorganismes
- Caractérisation génomique
La technique de PCR est a priori :
- très sensible ; elle peut dans certains cas s'appliquer directement à l'échantillon à analyser, supprimant ainsi les délais de mise en culture et les problèmes liés aux germes non cultivables ;
- très spécifique ; elle reste (et cela peut, par contre, être considéré comme inconvénient), une démarche orientée, pour le moment disponible pour un nombre restreint de microorganismes ;
- beaucoup plus rapide et automatisable.
Ø Dans le domaine de la santé
Technique de biologie moléculaire de haute sensibilité qui permet de détecter dans le sang et dans les tissus des fragments d’ADN et d’ARN de virus, de bactéries ou autres micro-organismes en les recopiant presque à l’infini. C’est cette technique et ses variantes qui servent à la recherche qualitative et quantitative des virus des hépatites B et C ainsi que du VIH. La PCR a permis le développement de tests ultra-sensibles pour le VIH et le VHC, grâce auxquels le diagnostic précoce de ces infections est possible, avant l’apparition des anticorps spécifiques de chacune d’elles. Elle est indispensable dans le domaine de la transfusion sanguine.
La recherche d'une pathologie
Recherche de parasites (ex : toxoplasmose), de bactéries (ex : tuberculose), de virus (ex : HIV), d'oncogènes (gènes impliqué dans la cancérogenèse, ex : papillomavirus) ou de translocations (ex : leucémie myéloïde chronique). On met en évidence l'absence, ou la présence, dans le prélèvement d'un fragment d'ADN spécifique de l'agent causal.
Le diagnostic anténatal
Identification sur un gène d'une mutation connue et identifiée (ex : mucoviscidose) ou d'une délétion (ex : myopathie de Duchenne), responsables et caractéristiques de la maladie recherchée.
Ø Le clonage acellulaire [4]
C’est l’une des applications les plus remarquables de la PCR. Elle permet d’isoler, c’est-à-dire de purifier un gène sans recourir aux méthodes traditionnelles de clonage moléculaire qui consistent à insérer une banque d’ADN dans un vecteur plasmidique qui est ensuite employé à transformer une souche bactérienne dont les clones, après sélection, sont criblés. La réalisation est beaucoup plus rapide et beaucoup moins aléatoire en utilisant la PCR.
On parle de clonage acellulaire, lorsqu’on utilise la PCR, car il est inutile d’employer un système cellulaire (bactérie, levure, cellule animale ou végétale) pour amplifier le clone.
Plusieurs cas de figure se présentent :
1/ La séquence du gène est connue ;
2/ La séquence du gène n’est pas connue, mais il appartient à une famille dont plusieurs membres ont déjà été clonés et séquencés, et dont on peut déduire par comparaison des séquences très conservées au sein de la famille ;
3/ La séquence n’est pas connue, mais le gène a déjà été cloné et séquencé chez d’autres espèces d’où l’on peut déduire des séquences homologues entre espèces ;
4/ La séquence du gène n’est pas connue, mais la protéine qui lui correspond a été purifiée et séquencée et l’on peut déduire une séquence nucléotidique dégénérée à partir de la séquence aminoacide (génétique inverse), ce cas peut se combiner avec les deux précédents ;
5/ Le gène et la protéine qui lui correspond sont inconnus.
Le cas (1) ne présente pas de difficulté, la connaissance des séquences permet de synthétiser les jeux d’amorces nécessaires à l’amplification.
Dans les cas (2) et (3), la difficulté augmente à cause des incertitudes en matière de séquence. Toutefois, les homologies sont assez fiables pour permettre de produire des jeux d’amorces performants à condition bien sûr que les espèces ne soient pas trop éloignées, ou que la famille du gène d’intérêt ne soit pas trop hétéromorphe. Le cas (4) peut poser des problèmes importants notamment dans la mesure où les séquences protéiques à partir desquelles les amorces sont déduites contiennent des aminoacides très dégénérés. Le cas (5) est quasiment désespéré.
Ø Autres
1- Détection de polymorphismes
- polymorphisme de restriction
- marqueurs microsatellites
2 - Médecine légale, Criminologie…
3 – Diagnostic des maladies héréditaires
4 – Séquençage
4- Avantages et Inconvénients
4.1- Avantages
La PCR est une technique très sensible car capable de générer une très grande quantité d’acide nucléique a partir de quelques copie de la séquence recherché.
- Sensibilité
• Faible quantité de matériel initial : à partir de quantité infinitésimale on produit une grande quantité de matériel génétique.
• Gain de temps / sérologie : la PCR permet en peu de temps d’identifier les différents types viraux présent
- Rapidité
• Gain de temps / culture : élimination des temps de cultures et d’incubation.
• Réponse extrêmement rapide
- Spécificité
• Discrimination
4.2- inconvénients [5]
La PCR reste une technique parfois délicate à réaliser et à interprété du faite
- des risques d’inter contamination lors des prélèvements sur les animaux ;
- de la possible dégradation des acides nucléiques en particulier de l’ARN ainsi que de la présence d’inhibiteurs de PCR lors de certains prélèvements ;
- de la contamination facile du milieu réactionnel lors de l’analyse au laboratoire ;
Ø Problèmes de contamination
- Donne des faux positifs.
- Dû à la sensibilité extrême de la technique
- Contamination par aérosols de produits PCR (Après amplification : 200 copies/pL or 1 aérosol = 1 pL)
Pour contrôler la contamination :
- Nécessité de contrôle négatif, sans ADN cible (témoin)
- Organisation du laboratoire (pièces pré-PCR, PCR, post-PCR)
avec matériel dédié et circulation mono-directionnelle
- Utilisation de pointes-filtres
- Aliquotage des réactifs
Ø Problème de la présence d’inhibiteurs
- Donne des faux négatifs.
- Certains sont connus (hème, DMSO, héparine, SDS, colorants, phénols…).
- D’autres inconnus (dans LCR, urines)
-Nécessité de contrôle positif ajouté dans l’échantillon (autre cible ou même cible modifiée)
- Pour lever l’inhibition :
* Diluer l’échantillon
* Purifier l’ADN
Conclusion
La PCR est technique intéressante et performante de laboratoire à pratiquer sous assurance qualité totale (locaux, matériels, consommables, procédure de travail).
Elle peut être mise en œuvre en compléments des autres méthodes de diagnostiques disponibles.
Référence bibliographique
[1] : http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/index.htm consulté le 09/05/09
[2] : http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm consulté le 09/05/09
[3] : http://fr.wikipedia.org/wiki/Réaction_en_chaîne_par_polymérase#Historique consulté le 09/05/09
[4] : http://www.congres-des-sciences.be/archives/2006/DOC-Siatka.pdf
[5] : http://www.med.univ-rennes1.fr/wkf/stock/RENNES20071031101610vdavidPCR_2007.pdf
La différence pas celle qui dérange
La différence réside dans l'infiniment petit comme dans l'infiniment grand. Elle est indispensable à l'échelle individuelle, familiale, sociale, planétaire ou même existentielle. C'est elle qui nous permet de nous propulser vers l'avant indéfiniment. Elle avait aussi permis la naissance de l'univers, dont l’existence avait fini par engendrer la nature humaine qui poursuit, à son tour, son évolution en n'étant jamais la même deux temps de suite.
Accepter la différence, c’est d’abord accepter qui nous sommes.
Pensez vous qu'il faille toujours accepter la différence et être tolérant envers des personnes qui nous correspondent pas. OUI
Faut il pour cela accepter l'immoralité, le manque de politesse, irresponsabilté... comme des signe de différence??? NON pas vraiment la différence certe mais essayons tousjours autant que possible d'accorder nos violons aux valeurs que la société a reconnu depuis toujous comme les vrais car la nature elle même adhère celles ci.
Accepter la différence, c’est d’abord accepter qui nous sommes.
Pensez vous qu'il faille toujours accepter la différence et être tolérant envers des personnes qui nous correspondent pas. OUI
Faut il pour cela accepter l'immoralité, le manque de politesse, irresponsabilté... comme des signe de différence??? NON pas vraiment la différence certe mais essayons tousjours autant que possible d'accorder nos violons aux valeurs que la société a reconnu depuis toujous comme les vrais car la nature elle même adhère celles ci.
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