La PCR

PLAN
Introduction
1- La PCR
1.1- Historique
1.2- Principe
1.3- Les étapes
1.4- Les phases d’un cycle

2- Les différents types de PCR

3- Domaines d’application

4- Avantages et Inconvénients
Conclusion

Introduction
La caractérisation génétique est la description la plus fiable d’une espèce et de l’individu à l’intérieur de l’espèce. Des techniques nouvelles ou améliorée permettent aujourd’hui d’avoir accès à l’information génétique. Ces méthodes les unes plus performantes que les autres se regroupent sous le thème de génie génétique ou de biologie moléculaire. Le génie génétique a connue un essor fabuleux avec l’invention de la PCR. Ainsi cibler un gène, l’amplifier afin d’une utilisation ultérieur sont désormais de routine dans les laboratoires de biologie moléculaire.
L’objet du présent document est de présenter la PCR dans ces différents contours. Il aborde également les différentes variantes de cette technique, ces avantages et inconvénients et les applications que l’on peut en faire.

1- La PCR
La «Polymerase Chain Reaction» ou PCR (ou encore ACP pour Amplification en Chaîne par Polymérase), est une technique de réplication ciblée in vitro.
Elle permet d'obtenir, à partir d'un échantillon complexe et peu abondant, d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur définie. L'ordre de grandeur à retenir est celui du million de copies en quelques heures.

1.1- Historique
1953 : Découverte de la structure en double hélice de l’ADN par James Dewey Watson et Francis Harry Compton Crick, (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1962).
1956 : Découverte de l’ADN polymérase ADN dépendante (ADN pol I) par Arthur Kornberg (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1959).
1970 : Co-découverte indépendante de l’ADN polymérase ARN dépendante par Temin HM et Baltimore D (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1975).
1986 : Première publication publique sur la PCR par Kary Mullis (prix Nobel de chimie en 1993).
1988 : Première PCR réalisée avec une ADN polymérase thermostable, provenant de Thermus aquaticus, par Saiki RK.
1991 : Première détection du produit de PCR par sonde (sonde d’hydrolyse) par Holland PM.
1992 : Invention de la PCR en temps réel par Higuchi R.
1995 : Première publication sur la TAIL-PCR par Liu YG
1996 : Mise au point des polymérases temporairement inactives et activables par la chaleur par Birch DE.
La PCR, méthode de Biologie Moléculaire a été mise au point en 1985 par Kary Mullis [1], la technique connaît un essor considérable à partir de la commercialisation (vers 1988), d'une ADN polymérase résistante aux températures élevées (la Taq polymérase), qui permet une automatisation de la technique [2]. La PCR est une technologie qui a bouleversé la biologie moléculaire. En moins de dix ans, cette technique (maintenant capable de faire plus d'un milliard de copies en moins d'une heure) s'est imposée dans les laboratoires. En revanche, la PCR en temps réel a dû attendre la mise sur le marché d'un certain nombre d'innovations technologiques avant de se développer et est encore considérée comme une méthodologie nouvelle

1.2- Le milieu réactionnel d’une PCR
Ø L’ADN (séquence cible) : La séquence cible représente le segment d'ADN qui sera amplifié (recopié de nombreuses fois). Elle détermine alors le choix du couple d'amorces ;
Ø Les amorces : Le choix des amorces doit tenir compte de plusieurs paramètres en même temps. Les règles basées sur ces paramètres permettent de définir le couple d'amorces le mieux adapté. Elles vont avoir un double rôle : en s'hybridant à l'ADN matrice, elles délimitent la région d’ADN à amplifier (étape 2 du cycle) et avec leur extrémité 3' OH libre servir d’amorce pour l’ADN polymérase ;
Ø L’enzyme (Taq polymérase) : Les ADN polymérases sont des enzymes qui synthétisent l'ADN de l'extrémité 5-prime vers l'extrémité 3-prime. Les polymérases utilisées en PCR sont extraites de bactéries vivant naturellement à des températures élevées comme les sources hydrothermales du fond des océans. Les premières ADN polymérases utilisées provenaient d'une bactérie thermophile (résistante à des températures très élevées), par exemple Thermus aquaticus (Taq polymérase) ou encore Pyrococcus furiosus (Pfu polymérase), Thermococcus litoralis (Vent ou Tli polymérase), Thermus thermophilus (Tth polymérase). De nos jours, les enzymes utilisées sont dites recombinantes, ce qui simplifie considérablement leur obtention, et leurs propriétés ont été largement modifiées pour les rendre plus efficaces, plus fidèles ;
Ø Les oligonucléotides (A, T, G, C)
Ø Autres
Le tampon :
Le tampon utilisé pour la réaction PCR sert à maintenir stable le pH du milieu réactionnel au niveau optimal pour la Taq polymérase (TrisHCl à pH basique 8,5 à 9). Il contient des cations bivalents Mg2+, cofacteurs indispensables pour la réaction de polymérisation avec la Taq polymérase. La présence dans le milieu réactionnel des cations bivalents Mg2+ et de cations monovalents (K+ ou NH4+) vont neutraliser les charges négatives des groupements phosphates au niveau de l’ADN et ainsi stabiliser les hybrides ADN/ADN. En pratique, la concentration en sel doit cependant rester compatible avec l’activité de l’ADN polymérase.

1.3- Principe
Le principe et les conditions expérimentales qui en découlent sont très simples. Il s'agit de réaliser une succession de réactions de réplication d'une matrice double brin d'ADN. Chaque réaction met en oeuvre deux amorces oligonucléotidiques dont les extrémités 3-prime pointent l'une vers l'autre. L'astuce consiste à utiliser les produits de chaque étape de synthèse comme matrices pour les étapes suivantes. Au lieu d'être linéaire, l'amplification obtenue est exponentielle.

1.4- Les phases d’un cycle
A température ambiante L’ADN bicaténaire adopte sa conformation en double hélice. Dans le schéma qui suit, nous considérerons qu’il n’y a qu’une molécule initiale d’ADN double brin dans la solution, la zone colorée (rose et orange) correspondant à notre amplicon (voir schéma sur page 8).
Chaque cycle de PCR est constitué de trois phases différentes à trois températures différentes : la dénaturation, l'hybridation (ou annelage) et l'élongation (ou extension des amorces).
La dénaturation (1 sur le schéma) : Le thermomètre indique que le tube est à la température de 95°C. A cette température, les liaisons faibles (triple entre C et G et double entre A et T) qui assuraient la cohésion de la double hélice d'ADN sont rompues pour donner deux simples brins d'ADN.
L’Hybridation (2 sur le schéma) : L’hybridation des amorces sur l'ADN repose sur le principe de l'appariement des bases complémentaires. Les amorces de taille très inférieure aux brins initiaux présentent une probabilité de « rencontre » avec les matrices plus élevée que celle des brins matrice entre elles.
Le choix de la température d'hybridation résulte d'un compromis entre plusieurs paramètres. Elle est calculée en fonction de la longueur et de la séquence des amorces. Elle est légèrement inférieure (environ de 5°C) au Tm qui est la température de demi-dénaturation. Pour calculer le Tm d’un oligonucléotide inférieur à 30 nucléotides, on utilise la relation suivante :
Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)
La température d'hybridation est, de toute façon, inférieure à la température de dénaturation et est comprise entre 40 et 65°C [2]
L’Elongation (3 sur le schéma) : la température es maintenu à 72°C Les amorces hybridées à l'ADN servent de point de départ (comme leur nom l'indique), à la polymérisation du brin d'ADN complémentaire de l'ADN matrice. La polymérisation se fait dans le sens 5’…3’ par ajout successif des désoxyribonucléotides (présents dans le mélange en large excès). Chaque base ajoutée est complémentaire de la base correspondante du brin matrice.
Remarquons que la polymérisation ne s'arrête pas lorsque la copie est de la longueur souhaitée. La copie de l'ADN initial génère donc des copies plus longues que souhaitées. Aussi les brins nouvellement synthétisés, sont limités à leur extrémité 5-prime par l'amorce. Au contraire leur extrémité 3-prime est éventuellement plus longue car la Taq polymérase poursuit généralement au delà de la longueur souhaitée.
L'extension des amorces à partir de l'ADN initialement présent dans le tube produit donc des brins d'ADN d'une longueur indéterminée, souvent appelés « brins longs ».
Comme leur accumulation dans le tube se fait de façon linéaire, leur quantité finale est directement proportionnelle au nombre de cycles réalisés [2]. Elles augmentent de manière linéaire (de 1 par cycle sauf si l’ADN natif se dégrade).
C’est en fin du 3ème cycle qu’apparaissent les deux premiers exemplaires du fragment recherché qui font l’objet de la PCR.
A la fin de chaque cycle la quantité d’ADN cible est doublée. Chaque brin servira à son tour de matrice pendant le cycle suivant. Après n cycle la quantité d’ADN est égale à 2n.


Evolution de la température et des différents types de brins d'ADN au cours des 4 premiers cycles de la PCR

2- Les différents types de PCR
Il existe diverses techniques associées à la PCR. Nous pouvons distinguer :

2.1- PCR multiplexe
La PCR multiplexe (multiplex PCR) est un protocole destiné à amplifier plus d’un amplicon à la fois, par l'utilisation d'au moins trois amorces par réaction de PCR. Les produits de PCR ne seront alors compétitifs que pour la polymérase, les dNTP et, éventuellement, le marqueur d’ADN. Il est également possible d’amplifier différents types d’ADN reconnus par un même couple d’amorces, tels les mimics. La PCR multiplexe peut se faire en point final (les produits de PCR étant usuellement différenciés par leur taille ou la présence d’un site de restriction) ou en temps réel (chaque produit étant mesuré par une sonde spécifique couplée à un fluorophore dont le spectre d’émission est différent des autres). Ses applications qualitatives sont nombreuses (détection de souche virale, de mutations, …) mais son aspect quantitatif ne fait pas l’unanimité.

2.2- Méta-PCR
La Meta-PCR est une méthode qui permet de donner une molécule d'ADN synthétique comprenant n'importe quelle combinaison d'ADN amplifiable par PCR dans n'importe quel ordre. Elle est effectuée dans un seul tube et se compose de deux différentes étapes de la PCR séparées par un cycle de dégel pour éliminer l'activité résiduelle de la polymérase. La Meta-PCR peut être utilisée pour accroître le débit des méthodes de numérisation et balayage des mutations.

2.3- PCR emboîtée
La PCR emboîtée, PCR gigogne ou PCR nichée (Nested PCR) est une PCR en deux étapes successives, avec deux couples d’amorce différents, le second liant des séquences situées à l’intérieur du premier amplicon. Cette technique était initialement utilisée pour réduire le risque de contamination (le produit final devait pouvoir interagir avec deux couples d’amorces, donc deux niveaux de spécificité). Elle est maintenant très utilisée par les virologues travaillant sur les virus à ARN qui peuvent avoir une haute mutabilité. Le premier couple d’amorces est conçu pour pouvoir accrocher les quelques parties stables du génome viral, le deuxième pour identifier le sous-type. Elle permet aussi une meilleure sensibilité du résultat.

2.4- PCR asymétrique
C'est l'amplification par PCR en présence d'une faible quantité d'une des amorces. Elle permet le séquençage direct des fragments amplifiés. Pendant les 20 à 25 premiers cycles, l'ADN double brin est généré, jusqu'à épuisement de l'amorce limitante et de l'ADN simple brin est produit pendant les 5 à 10 derniers cycles. Les rapports d'amorces utilisés sont de 50 pmole/1-5 pmoles/100 µL (1-3 pmoles simple brin après 30 cycles).

2.5- PCR à asymétrique thermique entrelacée
La PCR à asymétrique thermique entrelacée (TAIL-PCR ou Thermal asymmetric interlaced PCR) est un protocole complexe alliant les principes de la PCR emboîtée, de la PCR asymétrique par le Tm des amorces, la succession de plusieurs types de cycle favorisant l’hybridation de telle ou telle amorce, et des amorces dégénérées. Le but est d’obtenir un amplicon final spécifique d’une séquence d’ADN dont seule une extrémité est connue généralement dans l’optique de séquencer la partie inconnue. Cette méthode est très utilisée pour la marche sur chromosome ou la caractérisation des séquences variables des immunoglobulines.

2.6- PCR en gradient de température
Il s’agit d’une technique aidant à la mise au point d’un nouveau protocole de PCR. Elle nécessite des thermocycleurs capables d’assurer des températures différentes, pour une même étape, aux différents échantillons. Elle est surtout utilisée pour optimiser l’étape d’hybridation, notamment en PCR multiplexe.

2.7- PCR en temps réel ou PCR quantitative
La PCR en temps réel (Real-time PCR) est une révolution dans l’utilisation de la PCR, cette technique consiste à mesurer la quantité d’ADN polymérisé à chaque cycle (temps réel) grâce à un marqueur fluorescent. Elle permet par son principe de faire des mesures quantitatives (expliquant l'appellation PCR quantitative, qPCR) mais elle nécessite des thermocycleurs particuliers. Il ne faut surtout pas la confondre avec la RT-PCR (Reverse Transcription PCR), on préférera donc les appellations PCR quantitative ou qPCR. Certaines expériences en PCR compétitive ou PCR radioactive permettent l'obtention de mesure quantitative exploitable.

2.8- PCR en point final
La PCR en point final (end point PCR) est un terme qui est apparu en opposition à la PCR en temps réel. Il désigne toutes les tentatives de quantification à partir du produit final d’une réaction de PCR.

2.9- PCR par essais
La PCR par essais (Touchdown PCR) est un protocole utilisé pour amplifier de l'ADN faiblement représenté et/ou subissant une compétition sur leurs amorces par des produits de pseudo-gène. Il consiste à avoir une température d’hybridation très haute lors des premiers cycles afin d’assurer une forte stringence et donc une amplification spécifique. Une fois que la séquence d'intérêt devient majoritaire vis-à-vis de ses compétiteurs, la température d’hybridation est progressivement abaissée afin d’assurer une meilleure efficacité de PCR. L’efficacité n’étant pas constante tout au long de la réaction, il est très difficile (impossible ?) de pouvoir obtenir un résultat quantitatif sans biais.

2.10- PCR sur colonie
La PCR sur colonie (Colony PCR) est un protocole qui permet d'amplifier de façon simple de l'ADN de micro-organisme (bactéries, archées ou levures) en inoculant directement la colonie dans le milieu réactionnel de la PCR. Durant les premières étapes de dénaturation, les cellules sont lysées et leur ADN est libéré dans le milieu réactionnel. L'ADN ainsi libéré peut alors servir de matrice.
La PCR sur colonie est utilisée notamment pour vérifier l'efficacité d'une transgénèse. Elle fut très utilisée lors de la construction des BAC dans les grands programmes de séquençage.
La PCR sur colonie est largement utilisée en recherche microbiologique afin de caractériser sur le plan phylogénétique les souches étudiées.


2.11- RT-PCR
La RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) est une technique qui associe une transcription inverse (RT) suivie d’une PCR. Elle permet de synthétiser le brin complémentaire d’un ARN avec des désoxyribonucléotides en utilisant une ADN polymérase ARN dépendante (transcriptase inverse). Cet ADNc est généralement destiné à être amplifié par PCR (l'ADNc étant plus stable, il permet plus de liberté que les ARN pour les analyses suivantes). Il existe plusieurs variantes de la RT - PCR
RT-PCR en une étape
La RT-PCR en une étape (single step RT-PCR) est un protocole mélangeant les réactifs de RT et de PCR afin que les deux étapes puissent se faire sans avoir à ouvrir le tube. Cela permet de réduire le risque de contamination ou d’inversion d’échantillon mais il est plus difficile d’optimiser le milieu réactionnel pour chaque étape. Cela induit en outre un risque de biais pour normaliser l’étape de RT car cela implique d'utiliser la PCR multiplexe.
RT-PCR in situ
La RT-PCR in situ est une méthodologie consiste à réaliser la RT-PCR non pas sur des molécules en solution mais sur des coupes histologiques. Bien que les résultats ne soient que semi-quantitatifs, ils apportent en outre une information sur la localisation des transcrits dans le tissu.
RT-PCR quantitative
La RT-PCR quantitative (qRT-PCR) est une technique destinée à pouvoir quantifier un type d’ARN initialement présent dans un échantillon. Ce terme désigne l'utilisation de deux techniques successivement, une Transcription inverse suivie d’une PCR en temps réel. Objectif principal de la plupart des biologistes, elle soulève de vives polémiques quant à l’utilisation de calibrateur externe ou interne (gène de ménage). À l’exception de complexes protocoles utilisant des calibrateurs externes homologues compétitifs, elle ne permet qu’une quantification relative.

RT-PCR sur une cellule
La RT-PCR sur une cellule (single-cell RT-PCR) est une méthodologie qui permet d’étudier les transcrits d’une cellule unique, obtenue par patch-clamp, microdissection laser ou triage de cellules par activité de fluorescence (FACS en anglais pour Fluorescence activated cell sorting). Cette précision peut être nécessaire lorsque le tissu n’est pas homogène (cellules tumorales, feuillets cellulaires bien différenciés, etc.) mais la quantification va devenir moins précise à cause d’une amplification des effets stochastiques et nécessite donc une multiplication des mesures.

2.12- PAN-AC
Une autre technique d'amplification isotherme : "Polymérisation des Acides Nucléiques pour Apoptose Controlée". Les auteurs prétendent que cette technique pourrait être mise en oeuvre dans des cellules vivantes, et ainsi soigner diverses pathologies (HIV, Malaria, cancers...)[] mais ces affirmations n'ont été corroborées par aucune autre équipe pour le moment.

2.13- TP-PCR
La TP-PCR (TP pour Triplet Repeat primed), une variante complexe de la PCR, a été mise au point par Jon Warner en 1996 et est utilisée dans les amplifications des gènes comportant des triplets répétés, comme dans le cas de la Dystrophie myotonique de Steinert. La combinaison PCR-Séquençage ne peut pas être utilisée dans ces cas car la Taq polymérase fait des erreurs de réplication.

3- Domaines d’application
Les applications sont trop nombreuses pour être toutes citées. Elles consistent toujours à rendre décelable, et de ce fait analysable, de l'ADN, souvent présent à l'état de traces.

Ø Dans le diagnostic bactériologique virologie
- Détection et quantification de microorganismes
- Caractérisation génomique
La technique de PCR est a priori :
- très sensible ; elle peut dans certains cas s'appliquer directement à l'échantillon à analyser, supprimant ainsi les délais de mise en culture et les problèmes liés aux germes non cultivables ;
- très spécifique ; elle reste (et cela peut, par contre, être considéré comme inconvénient), une démarche orientée, pour le moment disponible pour un nombre restreint de microorganismes ;
- beaucoup plus rapide et automatisable.

Ø Dans le domaine de la santé
Technique de biologie moléculaire de haute sensibilité qui permet de détecter dans le sang et dans les tissus des fragments d’ADN et d’ARN de virus, de bactéries ou autres micro-organismes en les recopiant presque à l’infini. C’est cette technique et ses variantes qui servent à la recherche qualitative et quantitative des virus des hépatites B et C ainsi que du VIH. La PCR a permis le développement de tests ultra-sensibles pour le VIH et le VHC, grâce auxquels le diagnostic précoce de ces infections est possible, avant l’apparition des anticorps spécifiques de chacune d’elles. Elle est indispensable dans le domaine de la transfusion sanguine.

La recherche d'une pathologie
Recherche de parasites (ex : toxoplasmose), de bactéries (ex : tuberculose), de virus (ex : HIV), d'oncogènes (gènes impliqué dans la cancérogenèse, ex : papillomavirus) ou de translocations (ex : leucémie myéloïde chronique). On met en évidence l'absence, ou la présence, dans le prélèvement d'un fragment d'ADN spécifique de l'agent causal.

Le diagnostic anténatal
Identification sur un gène d'une mutation connue et identifiée (ex : mucoviscidose) ou d'une délétion (ex : myopathie de Duchenne), responsables et caractéristiques de la maladie recherchée.

Ø Le clonage acellulaire [4]
C’est l’une des applications les plus remarquables de la PCR. Elle permet d’isoler, c’est-à-dire de purifier un gène sans recourir aux méthodes traditionnelles de clonage moléculaire qui consistent à insérer une banque d’ADN dans un vecteur plasmidique qui est ensuite employé à transformer une souche bactérienne dont les clones, après sélection, sont criblés. La réalisation est beaucoup plus rapide et beaucoup moins aléatoire en utilisant la PCR.
On parle de clonage acellulaire, lorsqu’on utilise la PCR, car il est inutile d’employer un système cellulaire (bactérie, levure, cellule animale ou végétale) pour amplifier le clone.
Plusieurs cas de figure se présentent :
1/ La séquence du gène est connue ;
2/ La séquence du gène n’est pas connue, mais il appartient à une famille dont plusieurs membres ont déjà été clonés et séquencés, et dont on peut déduire par comparaison des séquences très conservées au sein de la famille ;
3/ La séquence n’est pas connue, mais le gène a déjà été cloné et séquencé chez d’autres espèces d’où l’on peut déduire des séquences homologues entre espèces ;
4/ La séquence du gène n’est pas connue, mais la protéine qui lui correspond a été purifiée et séquencée et l’on peut déduire une séquence nucléotidique dégénérée à partir de la séquence aminoacide (génétique inverse), ce cas peut se combiner avec les deux précédents ;
5/ Le gène et la protéine qui lui correspond sont inconnus.
Le cas (1) ne présente pas de difficulté, la connaissance des séquences permet de synthétiser les jeux d’amorces nécessaires à l’amplification.
Dans les cas (2) et (3), la difficulté augmente à cause des incertitudes en matière de séquence. Toutefois, les homologies sont assez fiables pour permettre de produire des jeux d’amorces performants à condition bien sûr que les espèces ne soient pas trop éloignées, ou que la famille du gène d’intérêt ne soit pas trop hétéromorphe. Le cas (4) peut poser des problèmes importants notamment dans la mesure où les séquences protéiques à partir desquelles les amorces sont déduites contiennent des aminoacides très dégénérés. Le cas (5) est quasiment désespéré.

Ø Autres
1- Détection de polymorphismes
- polymorphisme de restriction
- marqueurs microsatellites
2 - Médecine légale, Criminologie…
3 – Diagnostic des maladies héréditaires
4 – Séquençage

4- Avantages et Inconvénients
4.1- Avantages
La PCR est une technique très sensible car capable de générer une très grande quantité d’acide nucléique a partir de quelques copie de la séquence recherché.
- Sensibilité
• Faible quantité de matériel initial : à partir de quantité infinitésimale on produit une grande quantité de matériel génétique.
• Gain de temps / sérologie : la PCR permet en peu de temps d’identifier les différents types viraux présent
- Rapidité
• Gain de temps / culture : élimination des temps de cultures et d’incubation.
• Réponse extrêmement rapide
- Spécificité
• Discrimination

4.2- inconvénients [5]
La PCR reste une technique parfois délicate à réaliser et à interprété du faite
- des risques d’inter contamination lors des prélèvements sur les animaux ;
- de la possible dégradation des acides nucléiques en particulier de l’ARN ainsi que de la présence d’inhibiteurs de PCR lors de certains prélèvements ;
- de la contamination facile du milieu réactionnel lors de l’analyse au laboratoire ;
Ø Problèmes de contamination
- Donne des faux positifs.
- Dû à la sensibilité extrême de la technique
- Contamination par aérosols de produits PCR (Après amplification : 200 copies/pL or 1 aérosol = 1 pL)
Pour contrôler la contamination :
- Nécessité de contrôle négatif, sans ADN cible (témoin)
- Organisation du laboratoire (pièces pré-PCR, PCR, post-PCR)
avec matériel dédié et circulation mono-directionnelle
- Utilisation de pointes-filtres
- Aliquotage des réactifs

Ø Problème de la présence d’inhibiteurs
- Donne des faux négatifs.
- Certains sont connus (hème, DMSO, héparine, SDS, colorants, phénols…).
- D’autres inconnus (dans LCR, urines)
-Nécessité de contrôle positif ajouté dans l’échantillon (autre cible ou même cible modifiée)
- Pour lever l’inhibition :
* Diluer l’échantillon
* Purifier l’ADN

Conclusion
La PCR est technique intéressante et performante de laboratoire à pratiquer sous assurance qualité totale (locaux, matériels, consommables, procédure de travail).
Elle peut être mise en œuvre en compléments des autres méthodes de diagnostiques disponibles.




















Référence bibliographique
[1] : http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/index.htm consulté le 09/05/09
[2] : http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm consulté le 09/05/09
[3] : http://fr.wikipedia.org/wiki/Réaction_en_chaîne_par_polymérase#Historique consulté le 09/05/09
[4] : http://www.congres-des-sciences.be/archives/2006/DOC-Siatka.pdf
[5] : http://www.med.univ-rennes1.fr/wkf/stock/RENNES20071031101610vdavidPCR_2007.pdf